張志軍 黃雪梅 胡昌軍

(湖南醫(yī)藥學院檢驗醫(yī)學院，懷化 418000)

茯苓又稱玉靈、茯靈、萬靈桂、茯菟，為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，形如甘薯，球狀，外皮淡棕色或黑褐色，內(nèi)部粉色或白色。茯苓味甘淡，性平，有健脾補中、養(yǎng)心安神、利水滲濕的功能。我國食用茯苓已有長達千年的歷史，其功效廣泛，與多種藥材相配均能發(fā)揮其藥效，是一種重要的中藥藥材。茯苓多糖(Pachymaran)是從茯苓中提取的生物活性物質(zhì)，由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等成分組成，具有抗腫瘤、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1,2]。有研究發(fā)現(xiàn)，復方茯苓多糖口服液有抑制小鼠 S180 和 H22 腫瘤生長的作用，對實體瘤有顯著抑制作用，能增強巨噬細胞吞噬功能，促進小鼠淋巴細胞增殖和NK細胞活性，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能[3]。有研究表明，羧甲基茯苓多糖能夠有效逆轉(zhuǎn) TNF-α調(diào)控的體外 Caco-2 細胞系生物學特性，有可能是治療炎癥性腸病的潛在有效藥物[4]。DNA加合物(DNA adducts)是親電性的化合物或其代謝產(chǎn)物與生物體內(nèi)DNA形成的共價結(jié)合產(chǎn)物，是DNA化學損傷最重要和最普遍的形式。目前認為，外源化合物與DNA發(fā)生共價結(jié)合，形成的結(jié)合物一旦逃避自身的修復，就可能導致某些特異位點的基因突變，因此DNA加合物的形成被認為是致腫瘤過程的一個重要階段。它既可以作為分子水平暴露生物標志物來反映毒物到達靶部位的接觸劑量，又可以作為一種效應標志物，反映DNA受到有毒化學物質(zhì)損傷的效應程度。因此，抑制DNA加合物形成，對預防腫瘤的發(fā)生、保護機體健康有積極的效應。為進一步挖掘茯苓的藥用價值，本研究用ELISA法分析茯苓多糖對甲醛誘導小鼠DNA加合物含量的影響，以探討茯苓多糖的抗遺傳損傷效應。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器 茯苓多糖提取物(西安開來生物工程有限公司，茯苓多糖含量63.5%，臨用前用生理鹽水溶解稀釋至所需濃度)；甲醛(分析純，臨用前用生理鹽水配制成所需濃度)；DNA加合物檢測ELISA試劑盒(上海易利生物科技有限公司)；RT-6000酶標分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；TD24-WS低速自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.1.2實驗動物及分組 40只成年健康昆明種雄性小鼠由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供[許可證號為SCXK(湘)2009-0002，合格證號20-011]，體重20 g左右。用隨機方法將其分成陽性對照組(甲醛染毒)、茯苓多糖低劑量組(甲醛+2 g/L茯苓多糖)、茯苓多糖中劑量組(甲醛+4 g/L茯苓多糖)和茯苓多糖高劑量組(甲醛+8 g/L茯苓多糖)共4組，每組10只。

1.2方法 小鼠先在通風及光照良好的實驗室適應性飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲食及攝水，實驗室溫度為18～24℃，濕度為30%～40%，每晚7點喂食一次，每兩日更換一次飲水與墊料，飼養(yǎng)4 d后用于實驗。陽性對照組小鼠灌胃0.4 ml濃度為0.5 g/L的甲醛溶液，各茯苓多糖組小鼠灌胃0.2 ml濃度為1.0 g/L的甲醛溶液和0.2 ml不同濃度的茯苓多糖溶液(低劑量組2.0 g/L，中劑量組4.0 g/L，高劑量組8.0 g/L)，各組小鼠每次灌胃量均為0.4 ml，持續(xù)灌胃7 d后(陽性對照組死亡2只，茯苓多糖低劑量組死亡1只)摘眼球取血，1 500 r/min離心3 min分離血清，用ELISA法測定各組小鼠血清DNA加合物含量。

ELISA法(試劑盒)操作主要流程：①標準品稀釋。②加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。③溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。④配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。⑥加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。⑦溫育與洗滌：操作同前。⑧顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。⑨終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。⑩測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定在加終止液后15 min以內(nèi)進行。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

茯苓多糖對小鼠血清DNA加合物濃度有影響，4組間DNA加合物濃度差異有統(tǒng)計學意義(Kruskal Wallis Test，H=28.354，P<0.01)。茯苓多糖可減少DNA加合物的形成，且有劑量-效應關(guān)系，茯苓多糖劑量越高，DNA加合物濃度越低，小鼠血清DNA加合物濃度與茯苓多糖劑量呈負相關(guān)(Spearman等級相關(guān)系數(shù)rs=-0.869，P<0.01)。結(jié)果見表1。

3 討論

DNA加合物是近年來備受關(guān)注的除DPC(DNA蛋白交聯(lián)物)之外的另一類生物大分子的重要遺傳損害標記物，是環(huán)境理化因素對生物大分子物質(zhì)的一種重要遺傳損害，它的形成可影響基因的表達，破壞染色體的正常結(jié)構(gòu)，導致DNA復制過程中某些重要遺傳信息的改變和丟失，如果DNA加合物在細胞復制前沒有被修復或被錯誤地修復，則可導致基因突變，引起不可逆的基因損傷，進而誘發(fā)突變及腫瘤?？梢姡珼NA加合物的形成與致癌作用之間存在著一定的因果關(guān)系，是反映化學致癌進程中一個早期的可探測的生物標志物。

GroupsnDNA adductPositive control group8155.26±33.98Low dose of pachymaran9134.93±21.77Middle dose of pachymaran1079.53±11.051)High dose of pachymaran1063.75±14.671)

Note：Compared with positive control group，1)P<0.01.

甲醛是確定的人類致癌物，廣泛存在于環(huán)境污染物中，如住宅裝修所用人造板材(大芯板、復合地板)、油漆及卷煙煙氣會導致室內(nèi)空氣甲醛污染[5]?；顫姷娜┗恍枰?jīng)過機體代謝就能夠直接攻擊生物體內(nèi)的親核基團，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶，可與DNA分子發(fā)生共價結(jié)合形成醛類DNA加合物，屬堿基修飾類DNA損傷[6]。本研究中用甲醛染毒，確保實驗小鼠血清中有可供檢測的DNA加合物。

研究結(jié)果表明，當劑量高于2.0 g/L時，茯苓多糖具有較好的抑制DNA加合物形成作用，且存在明顯的劑量-效應關(guān)系，劑量越大，抑制效應越明顯，說明茯苓多糖具有較好的抗遺傳損傷作用。

可見，茯苓多糖作為天然免疫多糖，不僅能促進細胞免疫功能，還有明顯的抗遺傳損傷效應，值得開發(fā)應用。