崔懷中 王 瑩 孫少丹

(杭州市西溪醫(yī)院杭州市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,杭州 310023)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immuno-assay，CLIA)是化學(xué)發(fā)光與免疫分析相結(jié)合的一種分析方法。由于它具有靈敏度高、特異性好、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在臨床診斷等領(lǐng)域中得到了廣泛運(yùn)用[1]。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)蛋白類(lèi)腫瘤標(biāo)志物，已廣泛應(yīng)用于肝癌的診斷和治療監(jiān)測(cè)[2]。鉤狀效應(yīng)即Hook效應(yīng)是指免疫分析中由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致的假陰性或測(cè)定值小于真實(shí)值的現(xiàn)象?？乖贵w特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與抗原抗體的比例有關(guān)。無(wú)論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均只有在兩者比例合適時(shí)才出現(xiàn)最顯著的抗原抗體反應(yīng)，否則將可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果低于實(shí)際結(jié)果[3]。本文報(bào)告了使用CLIA測(cè)定AFP過(guò)程中，由于鉤狀效應(yīng)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際值的現(xiàn)象，并探討針對(duì)該現(xiàn)象的解決方案。

1 資料與方法

1.1資料 2017年6月18日在我院住院治療的患者，男，40歲，臨床診斷為肝惡性腫瘤，核磁共振(MRI)檢查結(jié)果為：“肝臟右葉巨塊型肝癌伴肝內(nèi)彌漫多發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，門(mén)脈內(nèi)廣泛癌栓形成，附見(jiàn)：兩肺彌漫多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤”。2017年6月18日至2017年12月31日本院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行AFP測(cè)定的標(biāo)本39 484份。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 抽取受檢者清晨空腹靜脈血約5 ml 于含惰性分離膠的促凝管中，靜置30 min，待標(biāo)本充分凝固后，4 000 r/min離心10 min后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)儀器為美國(guó) Beckman-Coulter DxI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀，試劑為原裝配套試劑，批號(hào)625284。所有項(xiàng)目檢測(cè)前均室內(nèi)質(zhì)控在控，所有操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

表1對(duì)AFP濃度為1154772ng/ml的標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后測(cè)定結(jié)果

Tab.1DeterminationofAFPconcentrationof1154772ng/mlaftergradientdilution

Dilution method(serum∶dilution)Relative light unitby instrumentInstrument displayresults(ng/ml)Theoreticalconcentration(ng/ml)1∶117 381 506>3 000577 3862∶117 012 470>3 000769 8483∶115 416 133>3 000866 0794∶115 337 849>3 000923 8185∶115 043 745>3 000962 3106∶114 052 4632 871989 8057∶113 654 4652 7551 010 4268∶113 245 5462 6071 026 464Undiluted12 355 4122 3031 154 772

Note：The method of determination is to dilute the specimen with the above ratio and then use the built-in dilution mode of the instrument.

2.1鉤狀效應(yīng)影響AFP測(cè)定結(jié)果的發(fā)現(xiàn)過(guò)程及處理措施 該標(biāo)本醫(yī)生同時(shí)開(kāi)了AFP測(cè)定和AFP稀釋測(cè)定(儀器預(yù)置的稀釋測(cè)定模式，稀釋倍數(shù)為18倍)，儀器測(cè)定的結(jié)果分別為2 303 ng/ml和>54 000 ng/ml。由于兩個(gè)結(jié)果間存在明顯的邏輯錯(cuò)誤，因此對(duì)該標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行手工的稀釋測(cè)定，經(jīng)500倍稀釋后測(cè)得結(jié)果為1 154 772 ng/ml。對(duì)于診斷為肝惡性腫瘤的患者來(lái)說(shuō)，AFP測(cè)定結(jié)果為2 303 ng/ml是完全可能的結(jié)果，可見(jiàn)如果該標(biāo)本醫(yī)生沒(méi)有同時(shí)開(kāi)AFP稀釋測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室將很有可能報(bào)告出一個(gè)錯(cuò)誤的結(jié)果。為避免可能錯(cuò)誤的發(fā)生，通過(guò)和儀器廠(chǎng)家工程師的溝通，我實(shí)驗(yàn)室決定將此后AFP>2 000 ng/ml 的標(biāo)本全部在儀器上進(jìn)行稀釋模式復(fù)測(cè)。從2017年6月18日至2017年12月31日本院實(shí)驗(yàn)室共測(cè)定AFP標(biāo)本39 484份，其中大于2 000 ng/ml標(biāo)本200份，144份標(biāo)本儀器直接給出了>3 000 ng/ml的結(jié)果。對(duì)其他56份儀器測(cè)定結(jié)果為2 000 ng/ml以上的標(biāo)本,經(jīng)稀釋復(fù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果標(biāo)本。期間對(duì)儀器測(cè)定結(jié)果為1 000～2 000 ng/ml的標(biāo)本，由于此結(jié)果段內(nèi)標(biāo)本數(shù)量較多，采用隨機(jī)抽取的方式抽取了100份標(biāo)本進(jìn)行稀釋復(fù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果。

2.2對(duì)高濃度標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后測(cè)定結(jié)果 對(duì)AFP濃度為1 154 772 ng/ml的標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?dāng)血清量與稀釋液量為6∶1時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)由于鉤狀效應(yīng)而導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果，此時(shí)稀釋后標(biāo)本的理論濃度為989 805 ng/ml。

3 討論

鉤狀效應(yīng)可導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏離實(shí)際值，如果實(shí)驗(yàn)室人員沒(méi)有發(fā)現(xiàn)則可能發(fā)出錯(cuò)誤的報(bào)告而影響到患者的診斷和治療，因此鉤狀效應(yīng)是免疫法測(cè)定中必須重視的問(wèn)題。化學(xué)發(fā)光法作為免疫分析的一種，必然也會(huì)存在鉤狀效應(yīng)[4]。DxI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀為避免鉤狀效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，當(dāng)測(cè)定時(shí)如果儀器測(cè)定的相對(duì)光單位(Relative light unit,RLU)大于一定的值時(shí)，儀器會(huì)直接給出>3 000 ng/ml的結(jié)果，而不給出具體的數(shù)值。但是如果AFP濃度過(guò)高則可能由于嚴(yán)重的鉤狀效應(yīng)使儀器給出一個(gè)錯(cuò)誤的結(jié)果[5]。由于A(yíng)FP在不同的肝癌患者中可能存在著巨大的差異，因此單從臨床診斷上通常難以發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤的存在。所以筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)所有測(cè)定值>2 000 ng/ml的標(biāo)本進(jìn)行稀釋復(fù)測(cè)，在39 484份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)3份標(biāo)本由于顯著的鉤狀效應(yīng)而得出了錯(cuò)誤的結(jié)果。雖然所占比例不足萬(wàn)分之一，但測(cè)定結(jié)果與真實(shí)結(jié)果相差巨大，如果發(fā)出這樣的錯(cuò)誤報(bào)告很可能對(duì)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室聲譽(yù)造成巨大影響，因此必須引起重視。在A(yíng)FP試劑的說(shuō)明書(shū)中提到“達(dá)到50 0000 ng/ml時(shí)，AFP測(cè)定不會(huì)表現(xiàn)出鉤狀效應(yīng)”，可見(jiàn)當(dāng)AFP濃度>500 000 ng/ml時(shí)就可能存在鉤狀效應(yīng)，但說(shuō)明書(shū)中并未對(duì)AFP濃度極高時(shí)儀器可能給出完全錯(cuò)誤的結(jié)果進(jìn)行明確的說(shuō)明。根據(jù)本研究對(duì)極高濃度標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋測(cè)定的結(jié)果，可見(jiàn)當(dāng)AFP濃度>98 9805 ng/ml時(shí)就會(huì)由于鉤狀效應(yīng)，儀器給出完全錯(cuò)誤的結(jié)果。因此筆者所在實(shí)驗(yàn)室采取了對(duì)所有測(cè)定值>2 000 ng/ml的標(biāo)本進(jìn)行稀釋復(fù)測(cè)，但目前所采用的>2 000 ng/ml必須稀釋復(fù)測(cè)的規(guī)則只是基于本實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的由于鉤狀效應(yīng)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果時(shí)儀器給出的結(jié)果均在2 000 ng/ml以上而定的，并無(wú)明確的理論依據(jù)。對(duì)于儀器測(cè)定值在2 000 ng/ml以下的標(biāo)本，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行部分標(biāo)本的抽樣稀釋復(fù)測(cè)中，未發(fā)現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的存在，但不能排除儀器測(cè)定結(jié)果為2 000 ng/ml 以下時(shí)存在鉤狀效應(yīng)的可能。因此還需要儀器生產(chǎn)商進(jìn)一步改進(jìn)儀器和試劑性能來(lái)避免此類(lèi)錯(cuò)誤的發(fā)生。

AFP是目前應(yīng)用最廣泛的診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志物，是臨床公認(rèn)的肝細(xì)胞肝癌診斷最敏感標(biāo)志物之一，其不僅在篩查和診斷中起重要作用，同時(shí)對(duì)原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)也起重要的作用[6,7]。其檢測(cè)結(jié)果一直受到臨床醫(yī)生和患者的高度重視，其檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性與患者的治療方案緊密相關(guān)，低于真實(shí)值的結(jié)果會(huì)給臨床醫(yī)生或患者錯(cuò)誤的提示，延誤治療或影響療效判斷。因此，作為檢驗(yàn)工作者必須要加強(qiáng)責(zé)任心，充分認(rèn)識(shí)到儀器可能存在的局限性以及鉤狀效應(yīng)可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的嚴(yán)重影響。對(duì)可疑的結(jié)果要及時(shí)跟臨床醫(yī)生進(jìn)行溝通并結(jié)合患者的病情及其他檢查結(jié)果綜合分析、討論，必要時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行復(fù)測(cè)或稀釋后復(fù)測(cè)避免因鉤狀效應(yīng)或其他原因?qū)е聶z驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)報(bào)。