肖建紅 李君君 張陽春

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,衡陽 421001)

免疫性血小板減少性紫癜(Immune thrombocytopenia,ITP)是一種自身免疫性出血性疾病，其主要特征是黏膜及皮膚出血和外周血小板水平低下，但是發(fā)病機理尚未完全闡明。大多學(xué)者認(rèn)為ITP的發(fā)病與機體免疫失調(diào)密切相關(guān)，由于體內(nèi)產(chǎn)生自身抗體同血小板表面抗原相結(jié)合，即體內(nèi)產(chǎn)生的對抗自身血小板抗體導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，尤其是脾臟的巨核細(xì)胞增殖分化、巨噬細(xì)胞增多、吞噬能力增強，繼而導(dǎo)致血小板生命周期縮短，血小板較少[1]，從而導(dǎo)致皮膚黏膜及重要臟器出血。

隨著分子免疫學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)研究的飛速發(fā)展，血小板減少性紫癜的研究也不斷深化；但針對ITP的治療方案卻無顯著性提升，依然還是依賴于傳統(tǒng)的激素、免疫抑制劑及脾切除等主要治療方式，一旦終止治療后容易再發(fā)，而過多使用又帶來副作用多和遠(yuǎn)期效果差等問題，因此一直困擾著臨床醫(yī)生。目前針對ITP的研究大多數(shù)建立在已經(jīng)應(yīng)用藥物的基礎(chǔ)上，并非亞臨床試驗。這樣有可能因發(fā)生其他并發(fā)癥而不得不停止[2,3]。為此，構(gòu)建一個合適的ITP模型可進一步闡明該病的發(fā)病機理及藥物的治療機制，并深入探索新的診治方法。由于ITP自身有關(guān)的病理特點，動物模型的應(yīng)該建立在和ITP疾病本質(zhì)相似的基礎(chǔ)上。當(dāng)前國內(nèi)、外對動物模型的構(gòu)建多使用外源性免疫法造模[4-6]或免疫法合并其他方法[7,8]。

本項目應(yīng)用注射豚鼠抗BALB/c小鼠血小板血清(Guinea pig anti-mouse platelct serum,GP-APS)免疫法造模，構(gòu)建和ITP患者發(fā)病特征相類似的小鼠ITP模型，為深入探討其病理機制及治療藥物機理和新藥研發(fā)奠定良好的研究理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 20只SPF級健康BALB/c小鼠，雌性，鼠齡6～8周，重量為18～22 g，購自中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心[動物合格證號：0084606]；小鼠飼養(yǎng)及實驗均在中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心清潔級動物實驗室內(nèi)進行。

1.1.2主要試劑與儀器 弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)和小牛血清白蛋白購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記重組蛋白A(Protein A/HRP)購于北京博奧森生物；EDTA-Na2購于廣州鼎國生物公司；全自動血液分析儀、ELITE流式細(xì)胞儀、低溫離心機、細(xì)胞離心機購自英國Shandon公司。

1.2方法

1.2.1豚鼠抗BALB/c小鼠GP-APS制備

1.2.1.1制備BALB/c小鼠血小板 取BALB/c小鼠，5%戊巴比妥鈉麻醉后以EDTA-Na2抗凝，從眼球取全血，1 000 r/min離心10 min，取上層血小板血漿(Platelet rich plasma，PRP)，離心10 min沉淀血小板，用pH7.4 0.01 mol/L PBS洗滌血小板，離心10 min后棄上清，連續(xù)3次，然后用pH7.4 0.01 mol/L PBS懸浮血小板，再計數(shù)血小板，最后調(diào)整血小板數(shù)至1×109ml-1。

1.2.1.2血小板抗原乳化和乳化劑鑒定 取制備好的血小板分別加入等量FICA和FCA，經(jīng)超聲混合成油包水狀乳劑，即FICA抗原和FCA抗原；抽吸少量準(zhǔn)備好的佐劑抗原滴入冷水中，保持好完整性，當(dāng)變成油滴樣，說明乳化良好，是較好的油包水型乳劑。

1.2.1.3免疫方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4,5,9]，取含F(xiàn)CA抗原1 ml注射于豚鼠背部、足掌、腹部等處的皮下，不少于4點/次；取含F(xiàn)ICA抗原1 ml分別于1、2及4周注射于豚鼠背部、足掌和腹部等處的皮下，不少于4點/次，操作完后局部消毒。第5周時再次麻醉小鼠，頸動脈取血，靜置30～60 min后，離心10 min后取上清，即為GP-APS，分裝并保存于冰箱溫度為-20℃以備用。

1.2.2ELISA檢測GP-APS效價

1.2.2.1依照上述方法分離血小板，用pH7.4 0.01 mol/L PBS懸浮血小板并將其調(diào)至1×109ml-1濃度。

1.2.2.2將準(zhǔn)備好的血小板懸液加入96孔培養(yǎng)板中，50 μl每孔，設(shè)置陰性對照孔，離心15 min。BSA封閉并4℃靜置過夜。

1.2.2.3取出培養(yǎng)板，用pH7.4 0.1 mol/L PBS漂洗3次，每次3 min，洗滌后分別按以下濃度(1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128濃度)加入50 μl GP-APS，在37℃水浴2 h。

1.2.2.4按照上述方法pH7.4 0.1 mol/L PBS洗滌3次，每孔加100 μl (1/3 000)Protein/HRP，37℃水浴反應(yīng)1 h。

1.2.2.50.1 mol/L pH7.4 PBS洗滌3次，方法同前，每孔加入底物檸檬酸鄰苯二胺基質(zhì)(OPD-H2O2液)100 μl，37℃避光反應(yīng)30 min。

1.2.2.6注入2 mol/L H2SO450 μl終止反應(yīng)；在波長490 nm下用酶標(biāo)儀檢測，讀取每孔OD值，≥陰性對照孔兩倍OD值則是陽性。

1.2.3GP-APS的預(yù)處理

1.2.3.1制備BALB/c小鼠紅細(xì)胞 BALB/c小鼠麻醉后，常規(guī)抗凝取血，將抗凝血置于離心管中，2 000 r/min 離心10 min以沉淀紅細(xì)胞，棄上清。加入8倍容量的生理鹽水，輕輕懸浮紅細(xì)胞，2 000 r/min 離心10 min，棄上清液，連續(xù)3次，然后懸浮紅細(xì)胞，配置5%終濃度的懸液。

1.2.3.2紅細(xì)胞吸附 將GP-APS從冰箱中取出，放在56℃水浴中孵育30 min進行補體滅活，然后用相同容積5%的BALB/c小鼠紅細(xì)胞懸液加入GP-APS中，37℃水浴1 h，再3 500 r/min離心10 min，留上清。上清液按相同的方法吸附2次，用鹽水稀釋成濃度1/4 GP-APS備用。

1.2.4ITP小鼠模型的建立

1.2.4.1動物分組 20只BALB/c小鼠，分為隨機兩組，即模型組、正常組，10只每組。模型組：根據(jù)文獻(xiàn)注射APS方法建立動物模型，于1、3、5、7、9、11及13 d，依照5 μl/g濃度將1/4稀釋的GP-APS注射小鼠腹腔，隔天一次。操作完后局部消毒。正常組：正常飼養(yǎng)，未進行任何處理；兩組小鼠均在第14天處死，取材進行各項數(shù)據(jù)檢測。

1.2.4.2觀察指標(biāo) 血小板檢測：在注射前、間隔期和結(jié)束時，即注射APS第0、1、3、5、7、9、11及13天，取100 μl小鼠尾靜脈血，滴入制備好抗凝劑1%EDTA-Na2 100 μl的EP管中，混勻后進行血常規(guī)檢測。

ELISA法檢測：血清PAIgG實驗結(jié)束時，在小鼠眼球取血，分離血清于-20℃冰箱儲存，ELISA檢測模型組和正常組小鼠血清PAIgG。96孔酶標(biāo)板分設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，檢驗步驟按操作說明進行。

觀察骨髓巨核細(xì)胞:結(jié)束后將小鼠處死，取其一側(cè)股骨。采用針頭抽取含1%胎牛血清白蛋白的PBS 2 ml 沖洗小鼠骨髓腔4次，取骨髓液0.5 ml注入2 ml PBS中，再取100 μl，300 r/min離心3 min。然后骨髓涂片和細(xì)胞染色，用光學(xué)顯微鏡計數(shù)巨核細(xì)胞100個，同時觀察巨核細(xì)胞分類(原始巨、顆粒巨、幼稚巨、裸巨和產(chǎn)板巨核細(xì)胞)和形態(tài)?；鶞?zhǔn)以直徑 6 mm/片的圓內(nèi)細(xì)胞數(shù)目，計算顯微鏡下巨核細(xì)胞數(shù)量。

脾臟指數(shù)及組織形態(tài)：實驗結(jié)束處死動物，取脾臟測重后并統(tǒng)計臟器指數(shù)(5 min內(nèi)取材)，臟器指數(shù)=臟器重量/體重(mg/g)。同時觀察臟器大體改變，如形態(tài)、外觀和有無瘀血等。再進行切片和HE染色，觀察組織病理。

2 結(jié)果

2.1GP-APS效價檢測 ELISA測定GP-APS效價，分別加入1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128不同濃度的GP-APS 50 μl，37℃水浴2 h，陰性對照孔不加GP-APS，可看出在稀釋為1/128時仍為陽性，表明小鼠已產(chǎn)生特異性抗體(見表1)。

2.2ITP小鼠模型檢測

2.2.1一般情況比較 注射過程中，模型組小鼠APS注射后第2天開始出現(xiàn)注射部位瘀斑，皮下小出血點，分布在四肢、腹部、尾部和耳部，且在注射點周圍最多。小鼠注射后出現(xiàn)短暫痙攣和抖動，精神差，進食和活動都減少。約1周后出血緩慢減輕，出血點變淺。注射1周后ITP模型組比正常組小鼠下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；注射2周模型組體重比正常組和造模前小鼠均有降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。注射前、注射1周和注射2周小鼠體重改變見表2。

2.2.2小鼠外周血小板水平比較 在試驗APS注射前、間隔期和結(jié)束時，即APS注射第0、1、3、5、7、9、11和13天，分別抽取100 μl尾靜脈血，通過不同時間段外周血小板水平比較可看出，在GP-APS注射后，ITP模型組小鼠各時間點血小板水平明顯減少，與正常小鼠和注射前比較，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)。在整個注射過程中，APS注射后24 h ITP小鼠外周血水平最低，然后隨APS注射天數(shù)延長模型組外周血小板水平輕微反彈，大概在注射第5天時血小板計數(shù)上升幅度最大。在造模的第7天到結(jié)束時都保持較低的水平。由此可以看出，GP-APS注射免疫法造?？梢允沟醚“逅浇档汀?見表3及圖1)。

表1ELISA法測定GP-APS效價

Tab.1PotencyofGP-APStestedbyELISA

ItemExperimental group(different concentration of GP-APS 50 μl)CONDilution1∶11∶21∶41∶81∶161∶321∶641∶128NegativeOD0.1980.1880.1760.1620.1310.1520.1420.1270.049

GroupsCase(n)Pretherapy1 week2 weeksNormal1020.10±0.9321.25±1.1822.33±1.42Model1020.08±1.0519.67±1.271)18.80±1.711)2)

Note：1)P<0.01；2)P<0.05.

GroupsCase(n)PLT(×109 L-1)0 d1 d3 d5 d7 d9 d11 d13 dNormal101 042±146990±1461 068±184951±1391 102±12410 008±124980±99997±83Model101 111±252 301±1001) 460±1103)518±1373) 349±1011) 331±1281) 379±1892) 421±1193)

Note：1)P<0.001；2)P<0.01；3)P<0.05.

GroupsCase(n)MegakaryocytePronucleus of MegGranule of Meg Plate of MegBare of MegNormal1060.50±9.8930.0±3.8056.4±3.177.6±1.716.0±0.82Model1083.4±6.991)31.3±4.4060.2±4.964.7±1.641)3.9±1.522)

Note：1)P<0.01；2)P<0.05.

圖1 各組小鼠不同時間點血小板水平比較Fig.1 Comparison for PLT level of mice at different time points

GroupsCase(n)PAIgG(pg/ml)Normal1017.02±0.86Model1021.22±0.721)

Note：1)P<0.01.

2.2.3巨核細(xì)胞檢測 模型組和正常對照組小鼠比較，骨髓巨核細(xì)胞計數(shù)顯著增多，然而裸巨和產(chǎn)板巨核細(xì)胞計數(shù)下降，有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P<0.01，P<0.05)。且和正常組小鼠相比，模型組的骨髓象表現(xiàn)出產(chǎn)板巨核細(xì)胞下降，巨核細(xì)胞成熟受阻。結(jié)果提示，GP-APS注射免疫法造模的骨髓和其巨核細(xì)胞分類與患者的ITP骨髓象巨核細(xì)胞特點相同，結(jié)合血小板改變，能斷定出免疫法可以建立ITP模型。各組巨核細(xì)胞和骨髓象比較見表4和圖2。

圖2 各組小鼠骨髓象比較(瑞氏染色,×200)Fig.2 Comparison for myelogram of mice in different groups(Wright stain,×200)Note: A.The myelogram in the normal;B.Megakaryocytes increased,and the plate and bare of megakaryocyte decreased in the model.

GroupsCase(n)Spleen indexNormal107.02±0.98Model1010.59±1.211)

Note：1)P<0.001.

2.2.4血小板相關(guān)抗體(PAIgG)水平 ELISA法檢測模型組和正常組小鼠血清PAIgG發(fā)現(xiàn)，ITP模型組PAIgG表達(dá)水平明顯高于正常組小鼠外周血PAIgG水平，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組PAIgG水平的比較見表5。

2.2.5脾臟指數(shù)比較 實驗結(jié)束后處死動物，取出脾臟，與正常組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯較大，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表6。

2.2.6脾臟組織形態(tài)及骨髓象觀察 模型組和正常組小鼠的脾臟形態(tài)及外觀無明顯差別，但模型組稍大。鏡下HE染色顯示，正常組被膜、白髓、紅髓界限明顯，偶見有散在的巨核細(xì)胞(圖3A)；與正常組比較，模型組小鼠脾臟白髓稍大，紅髓較小，淋巴細(xì)胞顯著增多，紅髓中可發(fā)現(xiàn)髓竇和髓索中較多的巨核細(xì)胞；高倍鏡下巨核細(xì)胞核體積較大，胞漿豐富(圖3B)。

圖3 各組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)比較(HE，×200)Fig.3 Comparison for spleen microstructure of mice in different groups(HE，×200)Note: A.The spleen microstructure in the normal;B.The spleen microstructure in the model.

3 討論

ITP是臨床中較為常見的自身免疫性出血性疾病，雖然確切的病因和發(fā)病機制至今尚不清楚，但大多數(shù)研究人員認(rèn)為ITP的發(fā)病和機體免疫功能失調(diào)關(guān)系密切，但導(dǎo)致其免疫功能異常的相關(guān)因素仍未明朗。大量文獻(xiàn)報道ITP患者因其機體產(chǎn)生抗體抗自身血小板，使得血小板壽命縮短，并被巨噬細(xì)胞破壞，臨床表現(xiàn)為外周血小板水平降低、骨髓巨核細(xì)胞計數(shù)明顯上升并發(fā)育成熟受阻，全身廣泛的皮膚黏膜，甚至重要臟器出血。針對ITP的病理特點，建立一個與臨床發(fā)病一致的ITP模型是近年來國內(nèi)、外研究的焦點。建立一個理想的、穩(wěn)定的、可操作性好的、能最大程度模擬人體狀態(tài)的動物模型，有利于研究其發(fā)病機制與探索安全有效的治療方法[10]。多年來，已有不少建立ITP的造模方法應(yīng)用于該研究，為研究ITP的發(fā)病機理和藥物治療機制提供了可行性。

當(dāng)前國內(nèi)外應(yīng)用于ITP動物模型的造模方式主要分為以下3種：化學(xué)藥物法，免疫介導(dǎo)法及60Co照射法[11-13]。化學(xué)藥物造模ITP是連續(xù)多次應(yīng)用環(huán)磷酞胺(Cytoxan)、白消安即馬利蘭(Busulfan)等化學(xué)類藥物腹腔注射或灌服小鼠，其原理是通過抑制小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致外周血小板水平降低?；瘜W(xué)藥物法雖然操作簡單，但是由于復(fù)制的小鼠模型不能準(zhǔn)確表現(xiàn)出ITP的臨床特征，現(xiàn)基本淘汰。至于60Co照射法，其造模法只表現(xiàn)較為短暫的骨髓抑制反應(yīng)，且有可能會自我恢復(fù)正常狀態(tài)，因而導(dǎo)致誤差，研究結(jié)果受到影響，目前已較少應(yīng)用。免疫介導(dǎo)法造模ITP小鼠，是應(yīng)用外源性抗體注射小鼠腹腔，造成外周血小板水平降低，同時導(dǎo)致骨髓巨核細(xì)胞增殖分化，是較為理想的造模方法，其操作簡單，成本低廉且干擾因素小，目前己在國內(nèi)外大量采用。

首次建立ITP動物模型報道于20世紀(jì)70年代， Bentfeld等[14]科研組采用反復(fù)給大鼠注射APS成功構(gòu)建了慢性ITP大鼠模型，重復(fù)APS注射5～6次/d，同時接連10 d注射APS，能夠使大鼠外周血小板維持在較低的水平。隨后， Stenberg等[15]在1990年在Bentfeld造模的基礎(chǔ)上又進行了進一步的深入探索，發(fā)現(xiàn)從應(yīng)用APS注射開始到停止后5 d內(nèi)血小板可降低以及巨核細(xì)胞增殖分化和形態(tài)等發(fā)生改變，研究時間也延長至12 d。國內(nèi)ITP模型研究稍晚，1994年，我國楊宇飛等[5]率先在國內(nèi)構(gòu)建BALB/c 小鼠模型，1周內(nèi)采用共6次反復(fù)APS注射，觀察骨髓象、外周血象和脾臟等組織臟器病理改變。楊宇飛的實驗結(jié)果闡明，此免疫法能夠?qū)TP小鼠血小板水平維持1周內(nèi)小鼠正常值的11%～25%。此造模法是外源性免疫介導(dǎo)法造模，應(yīng)用這種方法造模ITP主要表現(xiàn)是外周血小板水平降低，PAIgG上升，同時造成骨髓巨噬細(xì)胞增殖改變及產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞水平降低，完全與ITP發(fā)病機制相符合，是目前用于防治ITP研究中較為常用的動物模型造模法。

本研究應(yīng)用免疫介導(dǎo)方法構(gòu)建ITP小鼠模型，參照文獻(xiàn)同時予以改進，隔日注射1/4稀釋的GP-APS予BALB/c小鼠腹腔，共7次，以能夠使小鼠外周血小板維持在較低的水平。我們通過觀察得出，在整個研究過程中，APS注射后24 h模型小鼠外周血小板水平最低，然后隨著APS注射天數(shù)的延長ITP小鼠血小板水平稍有提高，大概在第5天時血小板上升的幅度最大，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道是相符合的[16]。雖然產(chǎn)生這種情況的具體機制還未闡明，可能和骨髓造血能力的代償和反饋作用相關(guān)[17]。在注射后第7天出現(xiàn)血小板計數(shù)保持在較低的水平，是正常值的15%～30%，此結(jié)論和國內(nèi)的文獻(xiàn)報道也相符[5]。另外，我們還觀察到，在注射APS后第13天，停注APS后血小板低水平維持時間最長(72 h)，也證實了以往的報道[18]。造模2周可作為預(yù)防或治療給藥的最佳觀測時間。

研究結(jié)果表明，采用外源性注射GP-APS的免疫造模方法，能使小鼠外周血小板保持在低水平，PAIgG增多，骨髓巨核細(xì)胞計數(shù)增多伴成熟受阻，ITP模型的血象和骨髓象以及臨床表現(xiàn)均和ITP患者相似，這種建模法能夠基本模擬ITP患者的發(fā)病特點，且技術(shù)簡捷，操作可行，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。