滕昊林 于金宇 劉 念 趙 軍 高寶山 薛立娟

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外二科,長(zhǎng)春 130021)

腎移植是治療終末期腎病的有效手段之一，而急性排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，隨著對(duì)器官移植免疫研究的不斷深入，臨床針對(duì)移植排斥反應(yīng)所采取的治療措施也更加積極有效，因此有關(guān)移植的排斥反應(yīng)機(jī)制及其預(yù)防和治療，更加受到科研和臨床醫(yī)務(wù)工作者的重視。

IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，是一種前炎性細(xì)胞因子，它通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞成熟和活化、炎細(xì)胞聚集、增殖抗原提呈細(xì)胞而在移植物局部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，參與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[1，2]。

本研究使用近交系 SD 大鼠作為供體，Wistar 大鼠作為受體，建立腎移植急性排斥模型，于術(shù)后第3、5、7天分別切除移植腎，每組每天6只大鼠，切除的移植腎部分置于10%福爾馬林溶液中固定、切片，隨后行HE、Masson、PAS、PASM等染色，光鏡下診斷急性排斥反應(yīng)。然后通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增腎臟總RNA和對(duì)病理切片進(jìn)行免疫組化的方法檢測(cè)剩余腎臟組織中的IL-17。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 RT-PCR 兩步法試劑盒、DNA Marker DL2 000、Trizol(均為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品)，IL-17特異性一抗(大鼠)武漢博士德公司，免疫組化UltraSensitiveTMS-P 試劑盒(鼠/兔)，β-actin 218、IL-17引物(大連寶生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠急性腎移植排斥反應(yīng)模型分組：正常雄性Wistar大鼠腎臟為正常對(duì)照組(Control組)；Wistar大鼠作為供受者的同系基因?qū)φ战M(STX組)；SD大鼠為供者，Wistar大鼠為受者的同種異體移植組(ATX組)；SD大鼠為供者，Wistar大鼠為受者，術(shù)后給予CsA的同種異體免疫抑制組(ATX +CsA組)。

每組在術(shù)后第3、5、7天獲得6只移植腎，部分置于10%福爾馬林溶液中固定、切片，剩余部分處理，液氮中凍存。大鼠移植腎mRNA按照試劑盒要求提取。逆轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，參照試劑盒要求。取20 μl PCR產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳，0.5%溴化乙錠染色 20 min。凝膠成像分析系統(tǒng)拍照及電泳條帶的強(qiáng)度分析，計(jì)算每一條目的片段與β-actin 218片段的強(qiáng)度比值，用來(lái)表示該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

免疫組化染色及結(jié)果的判定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求。所有切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，以集合系統(tǒng)上皮細(xì)胞膜有棕褐色染色者為陽(yáng)性細(xì)胞,通過(guò)圖像分析測(cè)得陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值(IOD 值)作為 IL-17蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果

2.1移植腎IL-17 mRNA表達(dá)特點(diǎn) 大鼠術(shù)后第3、5、7天移植腎組織IL-17 mRNA表達(dá)詳見(jiàn)表1，其結(jié)果表明，ATX組在第3、5、7天移植腎IL-17 mRNA均明顯升高，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中以第5天為最高(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而STX組和ATX+CSA組第3、5、7天移植腎IL-17 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1～3。

2.2移植腎IL-17免疫組化表達(dá)特點(diǎn) 大鼠組術(shù)后第 3、5、7天移植腎免疫組化結(jié)果，與正常對(duì)照組相比，ATX組大鼠術(shù)后第3、5、7天均出現(xiàn)不同程度的急性排斥反應(yīng)，移植腎IL-17 IOD值均顯著升高(P<0.05)， 以術(shù)后第5天移植腎IL-17 IOD值為最高，與術(shù)后第3天和第7天相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。STX 組、ATX+CsA 組大鼠移植腎術(shù)后第3、5、7天IL-17 IOD 值的變化與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2,圖1～3。

表1第3、5、7天IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量表達(dá)

Tab.1RelativeexpressionofIL-17mRNAatday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control0.895±0.1140.731±0.0530.590±0.142STX0.923±0.1280.757±0.0850.685±0.069ATX1.431±0.0361)1.741±0.0961)1.221±0.0891)ATX+CSA0.916±0.1180.830±0.0460.702±0.040

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

圖1 腎移植術(shù)后第3天各組IL-17免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)Fig.1 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 3rd day after renal transplantation (× 200)

圖2 腎移植術(shù)后第5天各組IL-17免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)Fig.2 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 5th day after renal transplantation (× 200)

圖3 腎移植術(shù)后第7天各組IL-17免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)Fig.3 Immunohistochemical results of IL-17 in each group 7th day after renal transplantation (× 200)

表2第3、5、7天IL-17免疫組化IOD值

Tab.2IODvaluesofIl-17immunohistochemicalonday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control6 493.07±1 259.17 6 317.34±1 094.476 521.22±1 147.80STX6 745.04±2 359.28 7 012.24±1 973.126 938.51±2 146.79ATX9 241.19±1 153.621)11 896.17±134.831) 9 587.68±1 306.421)ATX+CSA6 198.42±1 069.856 587.59±1 530.806 387.31±1 429.16

Note：Compared with the control group，P<0.05.

3 討論

早期急性排斥反應(yīng)是影響移植腎長(zhǎng)期存活和失功的重要危險(xiǎn)因素之一[3,4]，找到一種能在早期監(jiān)測(cè)移植功能狀態(tài)及其預(yù)后的指標(biāo)，是移植免疫學(xué)的重要工作和研究熱點(diǎn)。IL-17是具有多種功能的前炎性細(xì)胞因子，通過(guò)與其受體結(jié)合，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子釋放，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[5-7]。

在以往的大鼠腎移植模型研究發(fā)現(xiàn)，腎移植后第1天血清中IL-17水平出現(xiàn)增長(zhǎng)，第2天開(kāi)始在移植腎浸潤(rùn)的單核細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出明顯表達(dá)升高的IL-17，高峰期多出現(xiàn)在第5天[8,9]，本研究亦發(fā)現(xiàn)在ATX組的術(shù)后第3天、5天和7天移植腎IL-17表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤以第5天表達(dá)最顯著，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

越來(lái)越多的數(shù)據(jù)證實(shí)，IL-17直接或間接在細(xì)胞和體液免疫中參與腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生[10-12]，部分結(jié)果表明腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)升高的IL-17是早期獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，與移植腎預(yù)后有關(guān)[13]。由此可見(jiàn)IL-17在大鼠免疫排斥反應(yīng)模型中，早期即可出現(xiàn)，可以作為早期排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠腎臟移植排斥模型中IL-17在術(shù)后表達(dá)情況的變化，分別比較了大鼠排斥模型術(shù)后第3、5、7天的表達(dá)，對(duì)排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)IL-17表達(dá)與移植腎急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性及臨床意義進(jìn)行了闡述，在后續(xù)的進(jìn)一步研究中，我們力圖探討IL-17表達(dá)與體液排斥反應(yīng)及不同病理分級(jí)分期階段的特點(diǎn)和意義，為腎移植術(shù)后診斷和防治急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后判斷提供新的實(shí)用指標(biāo)。