■ 包鵬云 叢玉婷 李曉宇 徐永平

(1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；3.動物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧大連116620)

刺參屬于“海產(chǎn)八珍”之一，含有豐富的多糖、皂苷及膠原蛋白等多種生物活性物質(zhì)和礦物質(zhì)元素，具有藥食同補(bǔ)功能，對提高人體免疫力，抵抗各種疾病和應(yīng)激具有非常顯著的功效，頗受廣大消費者的認(rèn)可，成為最受歡迎的海產(chǎn)品之一。通過最近15年的發(fā)展，刺參養(yǎng)殖業(yè)已處于平穩(wěn)發(fā)展階段，養(yǎng)殖技術(shù)日趨成熟，市場供需處于較為平衡的狀態(tài)。2015年，刺參全國總產(chǎn)量達(dá)到20.58萬噸[1]，實現(xiàn)產(chǎn)值約300多億元，刺參已經(jīng)成為我國海水養(yǎng)殖業(yè)中單一品種，產(chǎn)值和經(jīng)濟(jì)效益最高的品種。刺參產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為北方沿海地區(qū)第一大漁業(yè)產(chǎn)業(yè)，對于實現(xiàn)漁業(yè)增效、漁民增收，促進(jìn)北方沿海地區(qū)新農(nóng)村建設(shè)和漁業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

刺參屬于低等的棘皮動物，是底棲的，腐屑食性，雜食性偏植物性的海洋經(jīng)濟(jì)類養(yǎng)殖動物。其索餌空間狹小，活動距離短，不能像魚、蝦等游泳動物一樣自由活動和選擇最適的生存環(huán)境和優(yōu)質(zhì)餌料，優(yōu)質(zhì)天然餌料的獲取是刺參生長非常重要的限制性因素之一。隨著刺參大規(guī)模池塘養(yǎng)殖和海上浮筏網(wǎng)籠養(yǎng)殖的開展，天然餌料已不能滿足刺參規(guī)?；B(yǎng)殖的實際需要，人工配合飼料的開發(fā)和應(yīng)用成為刺參營養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)研究的熱點。

決定刺參健康、生長和產(chǎn)品品質(zhì)的主要營養(yǎng)成分是飼料中的蛋白質(zhì)，飼料中所需的動物蛋白源的價格遠(yuǎn)高于植物蛋白源的價格，又因刺參的食性決定了其所攝食的配合飼料蛋白質(zhì)營養(yǎng)濃度較低，動物蛋白源又必不可少，為了控制刺參飼料成本，實現(xiàn)刺參飼料的營養(yǎng)平衡、環(huán)保與高效利用，本試驗在前期研究確定飼料中動植物蛋白比為1∶3時，刺參有最佳生長效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究飼料中發(fā)酵豆粕添加量對刺參生產(chǎn)性能和消化酶、免疫酶活性的影響，以期為動植物蛋白源魚粉、發(fā)酵豆粕、豆粕等在刺參配合飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼料配制

刺參配合飼料按等氮等脂原則設(shè)計和配制，生產(chǎn)魚粉含量為6.5%，動植物蛋白比為1∶3的6種配合飼料（D0為對照組，D4%、D8%、D12%、D16%、D20%五個試驗組飼料是用發(fā)酵豆粕按4%、8%、12%、16%和20%的比例取代日糧中豆粕）。其中以魚粉、大豆粕、發(fā)酵豆粕、玉米蛋白粉為動植物蛋白源，以馬尾藻粉和α-淀粉為碳水化合物，以魚油為脂肪源。所有飼料原料用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后95%以上過200目篩網(wǎng)，而后試驗用制粒機(jī)制成直徑5 mm的硬顆粒飼料，45℃風(fēng)干后裝于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

1.2 動物飼養(yǎng)與管理

試驗刺參，暫養(yǎng)階段的刺參放于室內(nèi)可控溫的水槽中投喂商品飼料,暫養(yǎng)15 d，溫度控制在(12±1)℃,使之逐漸適應(yīng)試驗水環(huán)境。暫養(yǎng)結(jié)束后，試驗刺參饑餓24 h，稱重，挑選個體大小均勻的健康刺參隨機(jī)分配到18個水槽(60 cm×40 cm×40 cm)中進(jìn)行飼養(yǎng)試驗。選取初始體重為(44.47±1.45)g刺參，隨機(jī)分為6組，每組3個平行，每個平行組15頭刺參。正式試驗持續(xù)40 d。每天投喂飼料為刺參體重的3%，以后根據(jù)每天各水槽中刺參的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整投喂量，以1～2 h攝食完為準(zhǔn),每天早晚各投喂1次,吸除殘餌和糞便，每天換新鮮海水三分之一。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫控制在12～15 ℃，鹽度28～32，pH值7.8～8.5，溶解氧高于5 mg/l，氨氮不高于 0.2 mg/l，亞硝氮不高于0.1 mg/l。

1.3 稱重與酶活性的測定

試驗結(jié)束后，將刺參饑餓24 h以排空其腸道內(nèi)的糞便，用干燥的白毛巾吸干體表水分，稱刺參的終末體重；從每個水槽取5頭刺參，用醫(yī)用注射器抽取體腔液4～5 ml后，將刺參于冰盤上解剖，用生理鹽水沖洗消化道內(nèi)容物，然后將生理鹽水與消化道內(nèi)含物按10∶1混合，并于冰浴下進(jìn)行勻漿，4℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行消化酶活性的測定。體腔液也進(jìn)一步在冰浴中用勻漿器勻漿，以便將各種細(xì)胞中的酶釋放出來，在4℃時，12 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于離心管中，在-80℃冰箱保存，待測定各項酶指標(biāo)。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性和總抗氧化能力的測定均采用試劑盒法（南京建成生物工程研究所）測定，操作步驟按說明書進(jìn)行。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼料營養(yǎng)成分的測定

試驗飼料和刺參體壁營養(yǎng)成分含量采用概率養(yǎng)分分析方法測定：干物質(zhì)含量采用烘干法測定，105℃烘干至恒重；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定；粗灰分含量采用高溫灼燒法測定，在550℃灼燒至恒重[2]。

特定生長率(%/d)=100×(lnW2-lnW1)/t增重率(%)=100×(W2-W1)/W1體壁系數(shù)(%)=100×FBW/W2

式中：W1——刺參的初始體重（g）；

W2——刺參的末體重（g）；

FBW——刺參的終末體壁重（g）；

t——試驗時間（d）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA),采用Duncan′s法多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗，P＜0.05為顯著性差異，用不同字母進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果

表2 飼料中發(fā)酵豆粕含量對刺參生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，本試驗中對照組刺參增重率、特定生長率和終末體壁重均小于發(fā)酵豆粕試驗組，且對照組的刺參增重率、特定生長率和終末體壁重與試驗組D12%、D16%和D20%比較差異顯著(P＜0.05)，而各組間刺參體壁系數(shù)差異不顯著。刺參增重率、特定生長率和終末體壁重都是隨著飼料中發(fā)酵豆粕含量的升高而先升高后降低，當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量提高到16%時，刺參增重率、特定生長率和終末體壁重達(dá)到最大值，高于對照組和試驗組。結(jié)果表明：當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量提高到16%時，本試驗中刺參各項生產(chǎn)性能指標(biāo)達(dá)到最優(yōu)。

表3飼料中發(fā)酵豆粕含量對刺參體壁營養(yǎng)成分的影響(干物質(zhì))（%）

由表3可知，與對照組相比，各發(fā)酵豆粕試驗組對刺參體壁營養(yǎng)成分(干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分)無顯著性影響,但各組間刺參體壁營養(yǎng)成分中粗蛋白質(zhì)含量存在差異。刺參體壁干物質(zhì)含量在7.80%～8.11%之間；粗蛋白質(zhì)含量在38.16%～43.17%之間，發(fā)酵豆粕16%試驗組刺參粗蛋白質(zhì)含量最高，豆粕含量20%的對照組刺參粗蛋白質(zhì)含量最低；粗脂肪含量在4.19%～4.50%之間；粗灰分含量在30.15%～33.85%之間。

表4 飼料中發(fā)酵豆粕含量對刺參消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，發(fā)酵豆粕顯著性影響胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性(P＜0.05)。試驗組中隨著發(fā)酵豆粕含量的提高，胃蛋白酶和胰蛋白酶活性隨之升高，脂肪酶和淀粉酶也有類似的變化趨勢。發(fā)酵豆粕含量為20%時，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最高，與發(fā)酵豆粕含量16%的試驗組差異不顯著,與其他各組比較差異顯著(P＜0.05)。豆粕含量20%對照組，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最低，與其它各組比較差異顯著。對照組與發(fā)酵豆粕4%、8%、12%的試驗組之間脂肪酶活性差異不顯著，但對照組脂肪酶活性顯著性(P＜0.05)低于發(fā)酵豆粕含量16%、20%的試驗組，發(fā)酵豆粕16%和20%的試驗組間脂肪酶活性差異不顯著。

表5 飼料中發(fā)酵豆粕含量對刺參體液關(guān)鍵酶活性的影響

由表5可知，本試驗中除堿性磷酸酶外，對照組與發(fā)酵豆粕各試驗組之間酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力差異顯著（P＜0.05）。隨著發(fā)酵豆粕含量的增加堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力都表現(xiàn)出升高的趨勢。除過氧化氫酶外，當(dāng)發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%～20%時，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力升高后趨于一致，二者之間差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于對照組和發(fā)酵豆粕4%試驗組（P＜0.05）。發(fā)酵豆粕含量達(dá)到20%時，過氧化氫酶活性顯著高于其它各試驗組。豆粕含量20%的對照組的酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力顯著低于其它各試驗組。

3 討論

蛋白質(zhì)是水產(chǎn)動物生長、繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，其在刺參營養(yǎng)需要中處于非常重要的地位，飼料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量影響刺參的攝食、生長、營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收等多種生理活動。飼料添加發(fā)酵豆粕對改善飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量有重要作用，可以提供豐富的氨基酸和肽類物質(zhì)。刺參屬于雜食性偏植物性的海洋動物，飼料中同時添加動物性蛋白源魚粉和植物蛋白源豆粕、發(fā)酵豆粕或其它植物餅粕等才能夠?qū)崿F(xiàn)動植物蛋白源優(yōu)勢互補(bǔ)，達(dá)到飼料氨基酸相對平衡，促進(jìn)刺參快速生長的目的。很多試驗證明魚粉含量偏低，對刺參生長有抑制作用[3-5]。本試驗中各組飼料中動植物蛋白比為1∶3，魚粉含量為6.5%，但隨著飼料中發(fā)酵豆粕含量的升高，魚粉與發(fā)酵豆粕的相對比值也呈現(xiàn)下降趨勢（1.63、0.81、0.54、0.41、0.32），發(fā)酵豆粕添加量的增加也起到替代魚粉的作用。在本試驗中刺參飼料中發(fā)酵豆粕含量對刺參的生長性能有一定的影響，當(dāng)飼料發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%時，刺參的特定生長率、增重率、體壁質(zhì)量達(dá)到最大值。沈城等（2015）[6]利用發(fā)酵豆粕替代15%魚粉，中華鱉的增重率和特定生長率均提高顯著且達(dá)到最大值；楊耐德等（2008）[7]發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦養(yǎng)殖實驗中發(fā)酵豆粕替代魚粉蛋白超過33.33%，則會降低凡納濱對蝦生長性能和飼料利用率；Lou等（2004）[8]在石斑魚上也發(fā)現(xiàn)用發(fā)酵豆粕替代魚粉比例超過7.4%可抑制生長。水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的種類不同，其所需要的必需氨基酸模型不同，配制的飼料中動植物蛋白源魚粉和發(fā)酵豆粕的最佳比例也有很大的差別，特別是發(fā)酵豆粕和魚粉的氨基酸組成差異較大。發(fā)酵豆粕做為優(yōu)質(zhì)植物蛋白源，雖然氨基酸組成相對平衡，但限制性氨基酸蛋氨酸和賴氨酸遠(yuǎn)低于魚粉中的含量，這可能是飼料中發(fā)酵豆粕添加量過高，魚粉蛋白相對含量降低后容易導(dǎo)致飼料利用率降低，影響刺參、魚蝦等水產(chǎn)動物生長的原因。

刺參的可食部分主要是刺參體壁，其營養(yǎng)和保健功能與體壁的質(zhì)量密切相關(guān)。飼料營養(yǎng)成分對刺參體壁質(zhì)量有一定影響。本試驗中飼料中發(fā)酵豆粕的含量對刺參體壁中粗蛋白質(zhì)有一定影響，當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%時，對刺參體壁蛋白質(zhì)的沉積作用達(dá)到最大值。對其它常規(guī)營養(yǎng)成分（干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分）影響不顯著。閆磊等（2017）[9]、程成榮等（2004）[10]和Liang等（2017）[11]通過實驗在洛氏鱥、雜交羅非魚和花鱸上證實了類似結(jié)果的存在。但是Luo等（2004）[8]、馮建等（2016）[12]、Lee等（2016）[13]和沈城等（2015）[6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代魚粉對中華鱉稚鱉、石斑魚、大黃魚和許氏平鮋肌肉的粗脂肪、水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量無顯著影響。呂云云等（2016）[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕對圓斑星鰈的體成分（干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分）的影響顯著(P＜0.05)。導(dǎo)致以上差異存在的原因可能是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物種類、發(fā)酵豆粕質(zhì)量、飼料中其它原料（如魚粉、豆粕等）添加量等因素綜合作用的結(jié)果。

很多學(xué)者開展了發(fā)酵豆粕對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物消化酶活性影響的相關(guān)研究，一般認(rèn)為適量添加發(fā)酵豆粕能夠提高水產(chǎn)動物的消化酶活性，過量添加則有抑制作用[6，15-17]，但對少部分水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的蛋白酶的影響不顯著，而對淀粉酶的影響顯著(P＜0.05)[18]。本試驗中發(fā)酵豆粕（4%～20%）試驗組與對照組比較蛋白酶和淀粉酶顯著升高，脂肪酶也有升高趨勢，但只有發(fā)酵豆粕16%和20%的試驗組脂肪酶顯著性高于對照組。這可能是由于對照組中豆粕含量高，胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子較多，抑制消化酶活性，而試驗組中發(fā)酵豆粕經(jīng)過酶解和微生物分解，使各種抗?fàn)I養(yǎng)因子顯著性降低或完全去除，并且發(fā)酵豆粕中氨基酸和肽類物質(zhì)可做為底物有誘導(dǎo)消化酶分泌和提高消化酶活性的作用。

刺參屬于無脊椎的海洋棘皮動物，不具備脊椎動物所特有的免疫組織和器官，主要通過非特異的細(xì)胞免疫和體液免疫完成對病原微生物和其它抗原物質(zhì)的免疫防御以及完成對體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物的清除工作，體液免疫反映主要由體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶等多種免疫因子共同決定[19-21]。刺參體腔液中主要免疫或抗氧化酶活性是衡量刺參機(jī)體生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。本試驗中發(fā)酵豆粕試驗組的酸性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力都顯著高于對照組(P＜0.05)，刺參體腔液中的這些酶類在清除機(jī)體氧自由基，防止生物分子損傷方面具有重要作用，是刺參非特異性免疫水平的高低的標(biāo)志。當(dāng)發(fā)酵豆粕替代魚粉量增加到25%以后，酸性磷酸酶、堿性磷酸酯酶、超氧化物歧化酶活性明顯下降，因此使用發(fā)酵豆粕時必須保證魚粉的最適使用量，否則會對中華鱉的非特異性免疫產(chǎn)生明顯的影響[22]。彭松等（2015）[23]利用發(fā)酵豆粕替代魚粉顯著性的提高凡納濱對蝦超氧化物歧化酶（SOD）活性，類似的試驗結(jié)果在許氏平鮋上也被發(fā)現(xiàn)。Song等（2014）[24]證實過多添加大豆蛋白水解物降低魚粉在飼料中的含量則會使星斑川鰈的超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力降低。由以上現(xiàn)象可以得出在刺參、魚蝦等飼料中動物蛋白源魚粉適量時，添加一定量的發(fā)酵豆粕可提高機(jī)體的免疫力和抗氧化能力，但具體機(jī)理和途徑，因水產(chǎn)動物的種類不同差異較大，有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在動植物蛋白比為1∶3的刺參飼料中，發(fā)酵豆粕添加量達(dá)到16%時，刺參生長、體壁蛋白質(zhì)含量達(dá)到最佳，消化酶活性、免疫酶活性都得到提高，具有一定的理論研究價值和生產(chǎn)應(yīng)用價值。