■曹笑楠 陳建軍* 曹香林

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

隨著人們對食品安全問題的關(guān)注，畜牧業(yè)生產(chǎn)對飼料添加劑的安全性不斷提出了更高的要求，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中為了確保水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，尋找綠色環(huán)保、安全高效的抗生素替代品成為目前的研究熱點[1]。營養(yǎng)性飼料添加劑能彌補飼料營養(yǎng)不足，有效改善畜禽及水產(chǎn)動物的產(chǎn)品質(zhì)量，對畜禽及水產(chǎn)動物的生長和疾病的預(yù)防都有積極意義。在生產(chǎn)中通過在飼料中添加營養(yǎng)性添加劑來防止魚類疾病的方法簡單易行，且具有良好效果，因此越來越受到人們的關(guān)注。

胍基乙酸(guanidinoacetic acid，GAA)是動物體內(nèi)產(chǎn)生肌酸的前體物，肌酸在動物機體內(nèi)能量新陳代謝中主要的能量儲存場所[2]，在ATP匱乏時，將磷供應(yīng)給ADP，再次產(chǎn)生ATP，加強機體的新陳代謝[3]。如今，在飼料中添加GAA對動物促生長機制的相關(guān)研究尚處于基礎(chǔ)階段，已有的研究主要集中在肉雞、育肥豬等飼料方面[4]，在水產(chǎn)動物飼料方面的研究較少。以芽孢類細菌、乳酸菌、酵母菌、雙歧桿菌等組成的復(fù)合EM菌，經(jīng)過數(shù)年的研究已被證明在魚類疾病防治，增強機體的免疫力，提高抗病、抗應(yīng)激能力，降低發(fā)病率和死亡率，促進動物健康生長等方面，具有一定的優(yōu)勢[5]。杜仲提取物是從植物中提取的天然物質(zhì)，能代替抗生素的綠色飼料添加劑。在動物養(yǎng)殖中應(yīng)用非常廣泛，可提高動物的生產(chǎn)性能、抗氧化能力和免疫功能，減少疾病的發(fā)生，并可改善肉的品質(zhì)[6]。

本研究首次將EM菌和GAA與杜仲提取物聯(lián)合應(yīng)用到鯉魚的養(yǎng)殖中，通過EM菌、GAA和杜仲提取物單一添加劑和EM菌與GAA、EM菌與杜仲提取物聯(lián)合添加飼喂，測定添加劑對鯉的生長性能、血清生化指標等，探究活性EM菌、GAA和杜仲提取物對鯉的生長及抗病能力等方面的影響，以期為水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯉魚由河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供；活性EM菌(保加利亞乳桿菌、丁酸梭菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母；活菌濃度6×105CFU/ml)由河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供；GAA、杜仲提取物(有效成分含量超過99%)和基礎(chǔ)飼料購于河南焦作某飼料有限公司，預(yù)混料購于河南通威飼料有限公司?；A(chǔ)飼料的配方及營養(yǎng)水平見表1；血清中酶活力測定用試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(%)

1.2 試驗設(shè)計與分組

選取540尾黃河鯉，初始體重(30.57±2.54)g，初始體長為(10.72±0.15)cm，試驗設(shè)5個試驗組和1個對照組，每組三個重復(fù)，每重復(fù)30尾。試驗設(shè)計與分組如表2所示。

表2 試驗設(shè)計與分組

1.3 飼料配制及試驗魚的飼養(yǎng)管理

按試驗設(shè)計的配比將飼料混勻，加入適量的蒸餾水，濕度以手握飼料成團為宜，加工成粒徑為2.5 mm的顆粒，曬干保存，并做好標記。試驗前水族箱用高錳酸鉀消毒,安裝充氧泵，保證水族箱充足的溶氧，水溫24℃；試驗魚分組后投喂基礎(chǔ)飼料，暫養(yǎng)一周后進行正式試驗，投飼率為2%，分三次投喂，試驗周期為38 d，每次投喂前先清除缸底的糞便及雜物，投喂1 h后要檢查攝食情況，并收集殘渣。

1.4 生長性能測定

正式試驗期第16 d和第31 d，稱取每組魚的體重、體長，計算凈增重、增重率、凈增長、增長率、餌料系數(shù)。

凈增重(g)=終末均重(g)-初始均重(g)

增重率(%)=[終末均重(g)-初始均重(g)]/初始均重(g)×100

凈增長(cm)=終末體長(cm)-初始體長(cm)

增長率(%)=[終末體長(cm)-初始體長(cm)]/初始體長(cm)×100

餌料系數(shù)=總餌料用量(g)/[終末均重(g)-初始均重(g)]

1.5 采血及血清中生化指標的測定

正式試驗期開始后，每隔10 d從各重復(fù)組中隨機撈取6尾試驗用魚進行心臟采血，所取血液裝入1.5 ml的離心管中，4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清裝入離心管中，冷藏于-20℃，用于檢測丙酮酸激酶（PK）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）的活力，測定方法參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行差異顯著性檢驗，如顯著則采用LSD進行多重比較，測定值用“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同飼料添加劑對鯉生長性能的影響（見表3、表4）

表3 不同飼料添加劑飼喂16 d對鯉生長性能的影響

表4 不同飼料添加劑飼喂31 d對鯉生長性能的影響

由表3可知，與基礎(chǔ)飼料組相比，在第16 d時，PF、PG、PD、PGF、PDF組的魚增重率分別提高了13.13、22.44、20.69、23.85、23.05個百分點，差異顯著（P＜0.05）；PF、PG、PD 三組組間差異不顯著，PGF、PDF組間差異不顯著。增長率分別提高了0.58（P＞0.05）、5.77（P＜0.05）、3.11（P＜0.05）、9.74（P＜0.05）、11.02（P＜0.05）個百分點；且單一添加劑飼料組中，添加GAA和杜仲提取物的增長率較添加EM菌高。餌料系數(shù)分別與對照組相比，各試驗組的餌料系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

由表4可知，在第31 d時，與投喂基礎(chǔ)飼料組相比，PF、PG、PD、PGF、PDF組的魚增重率分別提高了26.75、40.70、34.59、63.65、59.73個百分點，差異顯著（P＜0.05）；在單一添加組中PG較PF和PD兩組差異顯著（P＜0.05），增重最多；PG和PD兩組不顯著（P＞0.05）。增長率分別提高了 6.37、10.26、7.29、18.23、19.93個百分點，差異顯著（P＜0.05）；且單一添加飼料組中，添加GAA增長率最高。餌料系數(shù)分別與對照組相比，各試驗組的餌料系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

總之，與基礎(chǔ)飼料組相比，不同飼料添加劑對鯉的生長影響顯著，PF、PG、PD、PGF、PDF組的魚增重率、增長率、餌料系數(shù)與P組相比均差異顯著（P＜0.05）。在飼喂31 d時PG組增重率顯著高于PF組和PD組（P＜0.05），且PD和PF組之間差異不顯著（P＞0.05）；同時飼喂16 d和31 d時，PGF、PDF兩組的增重率、增長率和餌料系數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但均高于P組。結(jié)果表明復(fù)合添加組較單一添加組或?qū)φ战M對鯉生長影響顯著，獲得了較高的增重率、增長率。

2.2 不同飼料添加劑對鯉血清中生化指標的影響（見表5、圖1）

表5 不同飼料添加劑對鯉血清中酶活力的影響

由表5可發(fā)現(xiàn)：PF、PG、PD、PGF、PDF組的魚血清中PK的酶活力與對照組相比，在飼喂的第10 d分別升高 11.56、12.61、14.66、18.32、15.97 U/l，差異顯著（P＜0.05）。在第20 d和30 d時表現(xiàn)出相同的增長趨勢；SDH的酶活力在第10、20 d和30 d與對照組相比均顯著提高，單一添加GAA和杜仲提取物對SDH酶活力的影響在10 d和20 d時均顯著高于EM菌對SDH酶影響；CK的酶活力在正式飼喂的第10 d表現(xiàn)為PF、PG、PD、PDF組與對照組相比不顯著，而PGF組顯著降低（P＜0.05）；第20 d復(fù)合添加組PGF、PDF的CK酶活力與對照組比差異顯著（P＜0.05），PF組較PD組和PG組對CK酶活作用顯著（P＜0.05）；第30 d PF、PG、PD、PGF、PDF組CK酶活力與對照組相比均顯著降低。與投喂基礎(chǔ)飼料組相比，SOD的酶活力在飼喂的第 10 d 分別升高 30.49、23.29、17.35、61.41、49.35 U/ml，差異顯著（P＜0.05）；第20 d分別升高了37.76、43.00、39.12、73.12、65.52 U/ml，差異顯著（P＜0.05）；第30 d分別升高了55.12、68.56、59.95、88.08、111.85 U/ml，差異顯著（P＜0.05），PG組與PF組、PD組相比顯著提高（P＜0.05），PGF、PDF兩組組間差異不顯著。LSZ的酶活力較對照組顯著升高，并且GAA對酶活力的影響較EM菌更為顯著，且在30 d時，同時加入EM菌和GAA的顯著性更強。

本試驗研究結(jié)果表明，三種單二添加劑和二種復(fù)合添加劑都對鯉血清中PK、SDH、CK、SOD、LSZ的酶活力有所影響，PK、SDH、LSZ、SOD的酶活力表現(xiàn)出顯著性的升高，并且復(fù)合添加組對酶活力的影響較單一添加組更為顯著。由圖1可知：隨著飼喂天數(shù)的增加，不同的添加劑使鯉魚血清中PK、SDH、LSZ、SOD的酶活力均升高，說明隨著GAA、杜仲提取物和EM菌攝入量的增多，對魚血清中免疫相關(guān)的酶活力影響也逐漸增大，從而更加有助于鯉魚機體的能量代謝和免疫防御。

3 討論

3.1 不同飼料添加劑對鯉生長機能的影響

GAA是人和動物體內(nèi)合成肌酸的主要內(nèi)源性物質(zhì)，作為肌酸有效前體促進肌肉能量代謝，進而提高磷酸肌酸和ATP等高能量物質(zhì)的存儲量或利用效率,進而加快動物生長[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加GAA促使肉仔雞和育肥豬[8]肌肉中磷酸肌酸/ATP值升高，平均日增重顯著增加，料重比顯著降低。Michiels等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加600 mg/kg胍基乙酸可提高羅斯肉仔雞的平均增重和飼料利用率[9]。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加GAA使鯉的體重增長、體長增大，餌料系數(shù)降低，可能是飼料中添加的GAA作為潛在肌酸來源，減少了蛋白質(zhì)和脂肪的分解供能，產(chǎn)生能量積累提高鯉的生長性能。

EM菌作為新型的營養(yǎng)性飼料添加劑富含蛋白質(zhì)，進入機體后大量增殖并能抑制和排除有害菌，提高機體免疫力和存活率。Wang等每隔4 d用1×107CFU/ml的糞腸球菌處理羅非魚，經(jīng)EM菌處理的羅非魚體增重顯著高于未處理組[10]。本研究中，通過在基礎(chǔ)飼料中添加EM菌能促進鯉魚生長，原因一方面由于EM菌富含蛋白質(zhì)，另一方面可能是EM菌在增殖過程中分泌多種酶類，將魚體不能消化的大分子物質(zhì)分解成易被腸道細胞吸收的小分子物質(zhì)，進而更利于魚類的生長。

圖1 酶活力測定

姚紅梅等在飼料中添加杜仲提取物飼喂奧尼魚，添加不同劑量的杜仲提取物能顯著提高魚類生長速率,同時降低餌料系數(shù)[11]。杜仲提取物作為一種綠色的中草藥添加劑,含有抗菌、抗病毒的生化活性成分和多種營養(yǎng)成分，能提高動物的免疫應(yīng)答能力和抗病能力，在畜禽和魚類的養(yǎng)殖業(yè)中有其較好的發(fā)展前景[12]。本研究在飼料中添加杜仲提取物后也促進鯉魚生長，并降低餌料系數(shù)。

本研究中，通過在基礎(chǔ)飼料中分別加入3%EM菌、250 mg/kg胍基乙酸、3%EM菌+250 mg/kg胍基乙酸、0.15%杜仲提取物、0.15%杜仲提取物+3%EM菌來飼喂鯉，都能在不同程度上使鯉的體重和體長增加，餌料系數(shù)降低。同時也發(fā)現(xiàn)二種添加劑（如EM菌和GAA、EM菌和杜仲提取物）復(fù)合添加獲得了較優(yōu)的生長數(shù)據(jù)，說明二種添加劑的混合使用具有比較明顯的協(xié)同作用。由于單一添加劑的作用相對局限，因此多種添加劑的配合使用往往能取得更好的效果。

3.2 不同飼料添加劑對鯉免疫功能的的影響

本研究利用PK、SDH、CK、SOD、LSZ五種酶活力來評價鯉魚的免疫水平，使用的三種飼料添加劑及其復(fù)合制劑均可在一定程度上提高免疫酶的活力。

PK是糖酵解途徑的主要限速酶，它能作用于磷酸烯醇丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP[13]。本試驗中測定了五組不同添加劑對鯉血清中丙酮酸激酶活力，與對照組比均差異顯著，且復(fù)合添加組酶活力要高于單一添加組，可能添加劑的配合使用更強的促進機體的糖酵解從而促進機體生長。SDH是參與TCA循環(huán)過程的關(guān)鍵酶，此酶活力的上升與下降可以反映有氧代謝能力的高低[14]。本研究五組試驗中均顯著提高了血清中SDH酶活，說明GAA、EM菌和杜仲提取物能促進機體的有氧代謝進而改善生長性能。CK可以調(diào)節(jié)糖酵解循環(huán)，與生物體內(nèi)的能量代謝有很大關(guān)系[15]。血液中CK值是應(yīng)激反應(yīng)的一個重要特征,可作為衡量動物應(yīng)激程度的一個敏感指標，CK值升高說明動物受到一定刺激，可通過CK值檢測動物飲食和生活環(huán)境是否適宜。本試驗研究顯示，在30 d時試驗組CK值顯著降低。

SOD具有抗氧化作用，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能抑制氧自由基的形成，一定程度上反映了動物體生長發(fā)育及外界環(huán)境脅迫的變化，酶活力的上升與下降與動物的免疫力高低有很大的關(guān)系[16]。LSZ是一種堿性蛋白質(zhì)，廣泛存在于魚類各種體液、血清中的一種水解酶,是生物機體在免疫反應(yīng)過程中分泌的免疫因子，具有溶解細菌的作用,在動物的免疫防御中發(fā)揮重要作用[17]。有研究表明在飼料中添加杜仲提取物可以有效地提高建鯉的生長，并且大幅度提高體內(nèi)SOD活力以提高對應(yīng)激的抵抗能力[18-19]。

本研究表明，單一添加劑和復(fù)合添加劑都能對鯉魚血清中PK、SDH、CK、SOD、LSZ五種酶活力產(chǎn)生影響，且復(fù)合添加劑（如EM菌和GAA、EM菌和杜仲提取物）獲得了較優(yōu)的生長數(shù)據(jù)，體現(xiàn)為提高鯉魚的生產(chǎn)性能，提高免疫力，對鯉魚的能量代謝有一定程度的促進作用。目前較多研究局限于單一添加劑的使用，并且大多研究不同添加劑對畜禽類的影響，本試驗首次將EM菌與GAA和杜仲提取物配合使用在魚類養(yǎng)殖中，對水產(chǎn)動物的生長和疾病的預(yù)防都有著積極意義。