■陳亭亭 張巧艷* 王 坡， 林 琳 楊 華 楊蘭花 楊勝利 袁玉偉

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；3.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233；4.義烏出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江義烏322000)

伏馬毒素（Fumonisins，F(xiàn)Bs）是由層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticillioides）等絲狀真菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[1]，分子結(jié)構(gòu)見圖1。與絕大多數(shù)真菌毒素不同的是，它缺乏環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但仍具有很強(qiáng)的毒性[2]。其中，伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）污染率最高，占伏馬毒素總量的70%～80%，且危害最大，具有致畸性、致癌性，可誘發(fā)人類食管癌、豬肺水腫、馬腦白質(zhì)軟化等癥[1-3]。豬長(zhǎng)期攝入低劑量伏馬毒素污染的飼料還將導(dǎo)致日增重下降和免疫抑制[4]。近年來，調(diào)查顯示，玉米、大豆、小麥、DDGS飼料和全價(jià)飼料中伏馬毒素是主要的污染物[5]。2014年，我國(guó)華東地區(qū)抽檢的仔豬配合飼料中伏馬毒素檢出率為83.3%，雛禽、蛋禽配合飼料污染率達(dá)100%[6]。為了減少污染危害，美國(guó)FDA規(guī)定動(dòng)物飼料中伏馬毒素的限量范圍為5～100 mg/kg[7]。我國(guó)即將實(shí)施的《GB 13078—2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》特別新增了伏馬毒素的限量要求，其中豬飼料中的限量為5 mg/kg，牛飼料中的限量為50 mg/kg[8]。

飼料中伏馬毒素的污染不僅影響畜禽健康養(yǎng)殖，而且將通過食物鏈長(zhǎng)期威脅人類健康。高效安全的脫毒方法受到養(yǎng)殖企業(yè)、飼料企業(yè)以及獸醫(yī)專家的廣泛關(guān)注。大多數(shù)物理和化學(xué)脫毒法容易破壞飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，改變適口性，從而影響動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量；一些處理試劑的殘留蓄積還會(huì)帶來二次污染而造成不可估量的安全隱患。生物法脫毒包含微生物法和酶法。酶法因具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、相對(duì)安全等特點(diǎn)而廣受青睞，而且酶制劑相對(duì)于微生物制劑更容易保存，可直接以飼料添加劑形式用于畜禽生產(chǎn)中。本研究從緩沖體系、反應(yīng)溫度、酶濃度、底物濃度等方面首次探索了一種羧酸酯酶對(duì)FB1的降解規(guī)律(見圖1)，旨在為伏馬毒素酶法脫毒的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

圖1 伏馬毒素B1酶解示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

FB1標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。羧酸酯酶：從養(yǎng)殖場(chǎng)附近的土壤中篩選獲得一株革蘭氏陰性細(xì)菌，具有伏馬毒素降解活力，經(jīng)搖瓶發(fā)酵、初步純化制得粗酶。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器條件

采用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測(cè)。色譜柱：Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.05 mol/l檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.0），B相為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，55%B；2～4 min，55%B～75%B；4～9 min，75%B～90%B；9～9.5 min，90%B；9.5～13 min，90%B～55%B；13～15 min，55%B；流速：1.0 ml/min；激發(fā)波長(zhǎng)335 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量：50 μl；柱溫：35 ℃。

1.2.2 樣品處理

取一定體積的待測(cè)液，適當(dāng)稀釋，與反應(yīng)液Ⅰ和反應(yīng)液Ⅱ等體積混合衍生，過膜后檢測(cè)。反應(yīng)液Ⅰ：14 μl β-巰基乙醇溶于 4 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1）；反應(yīng)液Ⅱ：稱取10 mg鄰苯二甲醛，溶于1 ml甲醇中，再加入3 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1），混勻。其中反應(yīng)液Ⅱ在室溫下可穩(wěn)定1周[9]。

1.2.3 HFB1制備

取0.5 ml 200 μg/ml FB1甲醇溶液，與10 ml 1 mol/l KOH溶液混合，70℃孵育1 h，冷卻后用2 mol/l HCl溶液將pH值調(diào)至4.5。將反應(yīng)液用HLB柱凈化，獲得濃度為11.2 μg/ml的HFB1甲醇溶液，用作液相分析HFB1含量的參考標(biāo)樣[10-11]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 相關(guān)定義

酶活定義：在30℃、pH值8.0條件下，每分鐘從10 μg/ml FB1中降解1 μg FB1所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。FB1降解率定義：FB1的降解量與原始添加量之比，用百分比表示。HFB1生成率定義：HFB1的生成量與FB1完全轉(zhuǎn)化成HFB1的理論值之比，用百分比表示。結(jié)果均為3次測(cè)定的平均值。

1.3.2 緩沖體系

配制磷酸鉀緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）、Teorell-Stenhagen緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）[12]、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0），以及系列不同pH值的20 mmol/l Teorell-Stenhagen緩沖液（pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），分別在2 ml緩沖體系中加入FB1（10 μg/ml）、BSA（0.1 mg/ml）和酶（20 U/l），30 ℃孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測(cè)，比較降解效果。

1.3.3 反應(yīng)溫度

制備2 ml反應(yīng)體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，酶20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]，分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃中孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測(cè)，比較降解效果。

1.3.4 酶濃度

在 2 ml反應(yīng)體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加粗酶至終濃度分別為：1、10、20、40、100 U/l，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測(cè)，比較降解效果。

1.3.5 底物濃度

在2 ml反應(yīng)體系[BSA 0.1 mg/ml，酶 20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加底物FB1至終濃度分別為：1、5、10、20、50、100 μg/ml，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測(cè)，比較降解效果。

2 結(jié)果

2.1 緩沖體系的影響

緩沖鹽和pH值會(huì)影響酶、底物的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化。FB1的酶解在不同的緩沖體系中進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tris-HCl緩沖液有利于FB1的酶解，3 h的降解率達(dá)到47.08%，磷酸鉀緩沖液僅次之，Teorell-Stenhagen緩沖液效果最差（降解僅32.32%）。但由于Teorell-Stenhagen緩沖液具有相對(duì)較寬的緩沖范圍（pH值2.0～12.0）[12]，被進(jìn)一步用于考察酶解反應(yīng)的最適pH值。由圖2可知，該酶最適反應(yīng)pH值8.0，此時(shí)FB1降解率和HFB1生成率基本達(dá)到最高值。整體上看，F(xiàn)B1隨pH值變化的降解規(guī)律與HFB1生成規(guī)律基本一致，但降解率曲線與生成率曲線不完全重合，推測(cè)FB1酶解過程存在中間產(chǎn)物。Heinl等[1]也曾發(fā)現(xiàn)FB1的酶解產(chǎn)物除了HFB1外，還存在兩種結(jié)構(gòu)不同的部分水解型伏馬毒素B1（pHFB1）。而且，中間產(chǎn)物在降解產(chǎn)物中的比例可能與緩沖體系的pH值緊密相關(guān)，堿性條件相比酸性條件顯然更有利于FB1的完全轉(zhuǎn)化，可以解釋為：FB1通過羧酸酯酶水解生成HFB1、pHFB1和TCA，TCA能與堿發(fā)生中和反應(yīng)，促進(jìn)整個(gè)反應(yīng)向生成HFB1的方向進(jìn)行。另外，當(dāng)緩沖液的pH值小于3.0或大于11.0時(shí)，該酶幾乎無法降解FB1，可能過酸或過堿的條件不適宜酶與FB1的結(jié)合、催化，或者此時(shí)酶已變性失活。

圖2 反應(yīng)pH值對(duì)伏馬毒素B1酶解的影響

2.2 反應(yīng)溫度的影響

酶促反應(yīng)具有溫度依賴性，因?yàn)榉磻?yīng)溫度會(huì)影響分子運(yùn)動(dòng)、酶的活力和底物親和力。一方面，升高溫度可以增加酶促反應(yīng)速度；另一方面，溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性失活。FB1的酶解在不同的溫度下進(jìn)行，由圖3可知，最適反應(yīng)溫度為30℃。涉及的羧酸酯酶具有較寬的溫度適應(yīng)性，在20～70℃范圍內(nèi)均有降解活力，高于80℃時(shí)，F(xiàn)B1降解率幾乎為零，可能高溫不利于FB1的水解反應(yīng)或者此時(shí)酶已失活。另外，隨反應(yīng)溫度的變化，F(xiàn)B1降解和HFB1生成具有相似的趨勢(shì)，但降解率與生成率不一致，進(jìn)一步證實(shí)中間產(chǎn)物的存在，并推測(cè)中間產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)溫度緊密相關(guān)。

2.3 酶濃度的影響

通常，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。固定底物濃度為10 μg/ml，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進(jìn)行FB1的酶解反應(yīng)，考察不同酶濃度下的降解規(guī)律。由圖4可知，在酶解起始階段，隨著酶濃度的增加，同一時(shí)間的降解率增加。計(jì)算反應(yīng)3 h的平均速率，當(dāng)酶濃度低于40 U/l時(shí)，降解速率與酶濃度成正比；當(dāng)酶濃度為100 U/l時(shí)，降解速率增幅較小，可能此時(shí)底物分子趨向于被酶分子所飽和。較低的酶濃度（1 U/l）下反應(yīng)1 d，仍有36.91%的FB1殘留。較高的酶濃度（100 U/l）下反應(yīng)2 h，F(xiàn)B1的降解率已達(dá)到91.70%；反應(yīng)3 h以后，F(xiàn)B1的降解率和HFB1的生成率趨于100%，顯然此時(shí)FB1被完全轉(zhuǎn)化成HFB1，而HFB1沒有進(jìn)一步降解為其他產(chǎn)物，說明該酶專一性作用于酯鍵。當(dāng)酶濃度為20 U/l時(shí)，反應(yīng)8 h就能獲得較好的降解效果，此時(shí)FB1殘留僅剩10%左右。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在該酶濃度下，反應(yīng)前期（20 h前），降解率始終大于生成率，說明中間產(chǎn)物的存在；反應(yīng)后期（20 h后），降解率幾乎等于生成率，推測(cè)FB1酶解生成HFB1的反應(yīng)是不可逆的，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，中間產(chǎn)物pHFB1也能被完全水解成HFB1。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)伏馬毒素B1酶解的影響

圖4 酶濃度對(duì)伏馬毒素B1酶解的影響

2.4 底物濃度的影響

一般隨底物濃度升高，酶促反應(yīng)速度先升高后不變。固定酶濃度為20 U/l，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進(jìn)行FB1的酶解反應(yīng)，考察不同底物濃度下的降解規(guī)律。由圖5可知，在酶解過程中，隨著FB1濃度的增加，同一時(shí)間的降解率降低，可能過多的底物分子阻礙了酶分子的結(jié)合、催化。以圖5數(shù)據(jù)計(jì)算反應(yīng)3 h的平均速率，繪制底物濃度(S)與降解速度(V)的關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)FB1濃度低于50 μg/ml時(shí)，降解速率隨底物濃度的增加而增加，呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)；高于50 μg/ml時(shí)，降解速率基本保持不變，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)，說明此時(shí)酶已被底物完全飽和。由米氏方程推出：，繪制1/V-1/S關(guān)系曲線，可得：最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數(shù)Km為33.2 μmol/l。HFB1的生成規(guī)律與FB1的降解規(guī)律隨底物濃度變化的相關(guān)性趨勢(shì)基本一致，但同一時(shí)間的生成率幾乎都小于降解率，直至反應(yīng)1 d時(shí)FB1才完全轉(zhuǎn)化成HFB1，反映了FB1的酶解程度與作用時(shí)間緊密相關(guān)。反應(yīng)8 h，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應(yīng)20 h，各種濃度的FB1均能被降解。

2.5 實(shí)際應(yīng)用

圖5 底物濃度對(duì)伏馬毒素B1酶解的影響

從超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)、飼料企業(yè)獲得25份玉米粉，用李為喜等[13]的方法進(jìn)行樣品前處理，用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測(cè)，篩選獲得1份FB1含量為18.26 mg/kg的試樣，其液相色譜圖見圖6(B)。取5 g玉米粉試樣，以料液比1∶1.5加入20 mmol/l Tris-HCl緩沖液（pH值8.0）（包含20 U/l酶和0.1 mg/ml BSA），充分混合，在最適條件（pH值8.0、30℃）下靜止反應(yīng)1 d，F(xiàn)B1仍有35.67%殘留；靜止反應(yīng)2 d，F(xiàn)B1完全轉(zhuǎn)化成HFB1[圖6(C)]。假設(shè)玉米粉試樣中所有FB1均浸出于緩沖液中，估算底物濃度為12.17 μg/ml。由圖5可知，當(dāng) FB1濃度為 10 μg/ml時(shí)，反應(yīng) 8 h，降解率為94.57%；反應(yīng)20 h，降解率達(dá)到100%。推測(cè)玉米粉酶解過程中，固體基質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾了酶分子與底物分子的作用，從而影響了酶解效率。以后將優(yōu)化料液比，增加攪拌等措施，使酶分子與底物分子充分接觸，縮短完全降解時(shí)間。

圖6 玉米粉伏馬毒素B1酶解前后液相色譜圖

3 討論

DDGS（Distillers'dried grains with solubles）是釀酒酵母發(fā)酵玉米等谷物生產(chǎn)酒精的主要副產(chǎn)物，蛋白含量高（約30%～35%），營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好（富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和多糖），且產(chǎn)量較大、成本較低，近幾年已逐漸成為一種高需求的動(dòng)物飼料[14]。然而，玉米原料容易被伏馬毒素污染，加上酵母細(xì)胞壁和原料中的礦物質(zhì)會(huì)富集真菌毒素（發(fā)酵后FB1含量增加1.37～1.94倍），導(dǎo)致DDGS的安全性受到影響[15-16]。在發(fā)酵中添加降解毒素的酶制劑，可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程脫毒。按玉米發(fā)酵生產(chǎn)酒精的工藝，一般控制發(fā)酵溫度在30℃左右；而大多數(shù)酵母在微酸性環(huán)境中生長(zhǎng)最好，發(fā)酵pH值一般控制在5.0左右[17]。本研究涉及的羧酸酯酶在pH值5.0條件下可以降解伏馬毒素，最適酶解溫度為30℃，能夠適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。應(yīng)用羧酸酯酶，聯(lián)合其他酶制劑，開發(fā)脫毒DDGS產(chǎn)品，有利于提升國(guó)產(chǎn)DDGS品質(zhì)，應(yīng)對(duì)進(jìn)口貿(mào)易壁壘。

BSA（Bovine serum albumin）是一種常用的載體蛋白，由581個(gè)氨基酸殘基組成，可與多種陽(yáng)離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，防止酶的分解和非特異性吸附[18]。Fornasier等[19]報(bào)道，BSA可以增加酯酶的提取得率。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/ml FB1在20 U/l酶作用下水解3 h，不添加BSA的降解率僅有添加時(shí)的1/3，可見BSA能夠顯著提高羧酸酯酶的催化活力。Palacharla等[20]曾發(fā)現(xiàn)BSA具備捕獲脂肪酸的能力。由此推測(cè)，其作用機(jī)理是：BSA與FB1水解產(chǎn)物TCA結(jié)合，從而促進(jìn)FB1的酶解。此外，聚乙二醇（PEG）、吐溫（Tween）等一些非離子型表面活性劑，在促進(jìn)酶解方面展現(xiàn)了與BSA相當(dāng)?shù)男Ч鸞21-22]。以后將深入研究這些添加劑的作用機(jī)理，并結(jié)合不同酶濃度、底物濃度下的降解規(guī)律，開發(fā)復(fù)合型酶制劑和飼料脫毒技術(shù)，應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

本研究涉及的羧酸酯酶具有較強(qiáng)的pH值和溫度適應(yīng)性，最適反應(yīng)pH值為8.0，最適反應(yīng)溫度為30℃。酶解過程具有時(shí)間依賴性，且FB1的降解和HFB1的生成存在不同的規(guī)律。較低的酶濃度（1 U/l）下反應(yīng)1 d，有36.91%的FB1殘留；較高的酶濃度（100 U/l）下反應(yīng)3 h，F(xiàn)B1能被完全降解。當(dāng)酶濃度為20 U/l時(shí)，在最適條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)8 h時(shí)，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應(yīng)20 h時(shí)，低、中、高濃度的FB1均被降解。最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數(shù)Km為33.2 μmol/l。該酶作用于玉米粉，反應(yīng)2 d，能將FB1完全轉(zhuǎn)化成HFB1，應(yīng)用前景廣闊。