楊吉平 費 琳 趙朝華 李悅卓 茍興春△

(1 西安醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所,陜西省腦疾病防治重點實驗室,西安 710021;2 西安交通大學第一附屬醫(yī)院精神心理科,西安 710061)

腦缺血后損傷區(qū)細胞發(fā)生死亡的方式主要包括凋亡和壞死,既往研究多集中在前者,這種繼發(fā)性凋亡過程主要發(fā)生在缺血損傷區(qū)的周邊,即半暗帶區(qū),它是一種涉及多種基因及其蛋白質(zhì)相互作用的自主死亡的過程[1]。傳統(tǒng)觀點認為腦缺血后損傷區(qū)的核心成份主要是細胞壞死,它是一種被動的、無序性的過程,不受調(diào)控[2]。然而,近年來研究發(fā)現(xiàn)了一種非凋亡性的程序性細胞死亡方式,有壞死的形態(tài)學特點,能在干擾半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)介導(dǎo)的凋亡時觸發(fā),被命名為細胞程序性壞死(necroptosis)[3]。當細胞凋亡不能正常發(fā)生而細胞必須死亡時,壞死作為凋亡的“替補”方式被激活,最近有研究表明,necroptosis參與了腦缺血后損傷區(qū)的病理變化和進程[4-5]。但是,腦缺血后局部發(fā)生程序性壞死的具體細胞和分子機制尚不完全清楚。因此,本研究擬建立永久性小鼠大腦中動脈閉塞(pMCAO)模型,探索腦缺血后損傷區(qū)發(fā)生程序性壞死的時間變化規(guī)律、細胞類型以及 necrostatin-1(一種特異性的受體相互作用蛋白-1激酶抑制劑,Nec-1)對其保護作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

碘化丙啶(PI)(Sigma公司);兔抗NeuN抗體和兔抗GFAP抗體(武漢博士德);兔抗Iba-1抗體和磷酸化MLKL(pMLKL)抗體(Milipore);抗小鼠β-actin(Santa Cruz)。Nec-1(Abcam),ZH-ZKL型動物手術(shù)顯微鏡(安徽正華生物設(shè)備公司);線拴(美國Doccol);ABS型小動物氣體麻醉機和異氟烷(上海玉研科學儀器有限公司);激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV-1000);電子顯微鏡(Philips CM-120),WB成像系統(tǒng)(上海Tannon)。

1.2 實驗動物分組及給藥

30只雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量25～30g,由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供,許可證號為SCXK(陜)2007-001,隨機分為假手術(shù)組、模型組和Nec-1給藥組。模型組及Nec-1給藥組進行腦缺血模型,假手術(shù)組不插線,其余過程相同。按照文獻方法和劑量[6-7],Nec-1給藥組小鼠在造模前10min給予左側(cè)側(cè)腦室注射6μl Nec-1。Nec-1為10mg包裝,以DMSO溶解配制成100mmol/L,分裝保存于-80℃,使用前用生理鹽水稀釋成4mmol/L。

1.3 建立小鼠永久性大腦中動脈阻塞模型

3%異氟醚吸入麻醉誘導(dǎo)及維持,將麻醉好的小鼠置于動物手術(shù)顯微鏡下,背位固定,消毒,取頸正中切口,暴露氣管,分離右側(cè)頸總動脈并穿2根縫線備用,再分離頸內(nèi)、頸外動脈,并結(jié)扎頸外動脈。在已分離的頸總動脈近心端用縫線結(jié)扎,遠心端用動脈夾阻斷血流,在此之間,剪一小口,將選擇好的線栓插入小口,去掉動脈夾,然后緩慢推入至大腦前動脈起始端(6～7mm),通過阻斷大腦中動脈的血供局灶性腦缺血,縫合皮膚。假手術(shù)組只分離動脈但不插線。術(shù)中保留自主呼吸,使用肛溫探頭監(jiān)測肛溫,通過恒溫加熱板將小鼠體溫維持在 37.0℃±0.5℃。

1.4 組織細胞碘化乙啶(PI)染色

選取建立pMCAO模型小鼠3只,分別于術(shù)后6h、12h、1d、3d、5d、7d進行在體組織細胞PI染色。在相應(yīng)時間點灌注前1h,生理鹽水稀釋PI(10mg/ml),按20mg/kg劑量給予腹腔注射,每只小鼠用量不超過100μl,整個過程需注意避光。

1.5 免疫組織熒光染色

用1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射將小鼠麻醉后,用0.01mol/L PBS(pH 7.4)沖血,4%多聚甲醛(PFA)灌注后取材,置30%蔗糖4℃至組織沉底,然后連續(xù)冠狀冰凍切片。染色前將切片置室溫3～4h晾干。然后將切片置于含3% BSA及0.3% Triton X-100 的封閉液中封閉透膜 1h,按如下稀釋比加入一抗：抗NeuN 1∶200,抗GFAP 1∶300,抗Iba-1 1∶400。室溫過夜。PBS漂洗后,分別避光加入相應(yīng)FITC標記的二抗：1∶1000。室溫孵育2h,PBS漂洗后,按1∶5000入Hoechst,水洗,封片,于激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。

1.6 免疫電鏡技術(shù)

用4% PFA加0.05%戊二醛灌注固定,取材,后固定2～4h;從損傷區(qū)邊緣行冠狀位振動切片,厚度50μm;PBS漂洗;5%BSA+5%NGS+0.05%Triton X-100封閉2h后PBS漂洗;加pMLKL一抗(1∶500),室溫孵育24h,PBS漂洗;加相應(yīng)二抗(1∶2000),4℃,孵育過夜;PBS漂洗;用2%戊二醛固定45min,去離子水漂洗;避光進行銀加強,去離子水漂洗后,再用0.1mol/L PB漂洗;1%鋨酸/0.2mol/L PB溶液室溫固定1h;0.1mol/L PB漂洗,每次5min;依次梯度乙醇和丙酮脫水,然后包埋,聚合;修塊后行100nm超薄切片;銅網(wǎng)撈起切片,晾干;進行鉛、鈾染色;去離子水沖洗銅網(wǎng),吸取多余水分,晾干后電子顯微鏡下觀察。

1.7 免疫印跡檢測

于術(shù)后3d取各組小鼠損傷側(cè)皮層腦組織,免疫印跡檢測Nec-1對pMLKL蛋白表達的影響。小鼠斷頭后,以損傷區(qū)為中心,邊緣旁開約0.5mm為范圍取皮層組織于1.5ml EP管中,每管加入RIPA(pH 7.4)200μl,超聲裂解20min,4℃,12000r/min,離心20min;上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中,采用BCA法蛋白定量。取等量總蛋白上樣,以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5% 脫脂奶粉封閉1h,TBST漂洗后,分別加入pMLKL 1∶500和β-actin 1∶3000,4℃過夜,TBST漂洗后,加入1∶5000 HRP標記的二抗,室溫孵育2h。TBST漂洗后ECL發(fā)光,蛋白表達條帶用Image J軟件進行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 腦缺血后不同時間點的細胞壞死數(shù)量分析

在體細胞PI染色結(jié)果顯示,在造模后6h,缺血區(qū)已經(jīng)開始出現(xiàn)PI陽性細胞,且隨時間推移PI陽性細胞數(shù)量逐漸增多,到腦缺血后1～3d時達到最多,約769/mm2。在缺血后第5天,PI陽性細胞逐漸開始減少,缺血后第7天時,PI陽性細胞明顯減少(圖1)。

2.2 腦缺血后不同時間點壞死細胞的類型分析

免疫組織熒光觀察可見,在腦缺血后第3天,損傷區(qū)PI陽性細胞約80%與NeuN共標(圖2A),很少與GFAP和Iba-1共標。在腦缺血后第7d,損傷區(qū)PI陽性細胞總體數(shù)量減少,大部分分布于損傷區(qū)周邊,主要與GFAP和Iba-1共標,GFAP+細胞呈現(xiàn)胞體增大,突起增多、增粗,呈現(xiàn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞形態(tài)特征(圖2B)。Iba-1+細胞胞體也變大,形態(tài)清楚,突起伸長變粗,成阿米巴樣形態(tài)(圖2C)。

2.3 腦缺血后損傷區(qū)細胞的超微結(jié)構(gòu)和pMLKL的分布

免疫電鏡顯示,經(jīng)pMCAO處理后第3天,損傷區(qū)可見神經(jīng)元細胞膜破裂,細胞器結(jié)構(gòu)異常、紊亂,有空洞形成,呈現(xiàn)壞死的超微結(jié)構(gòu)特征,pMLKL 的膠體金顆粒主要沉積于神經(jīng)元胞體內(nèi)(圖3A)。腦缺血術(shù)后第7天,損傷區(qū)周圍可見大量的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞募集和浸潤,有一些細胞也呈現(xiàn)出壞死的超微特征,pMLKL的膠體金顆粒主要分布在這些星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)或細胞膜上(圖3B、C)。

2.4 Nec-1對腦缺血后損傷區(qū)pMLKL蛋白表達的影響

免疫印跡檢測各組大鼠腦缺血后3d損傷區(qū)組織的pMLKL蛋白表達,pMLKL條帶清晰地表達在54kDa 左右(圖4),與相應(yīng)的β-actin條帶進行相對灰度值分析顯示,模型組損傷區(qū)pMLKL的表達較對照組明顯升高(P<0.01);與模型相比,Nec-1給藥組pMLKL的表達明顯下降(P<0.01)。

圖4 Nec-1對腦缺血后損傷區(qū)磷酸化 MLKL 蛋白表達的影響Fig 4 The effects of Nec-1 on pMLKL expression in the injured area after cerebral ischemia Western blotting.**P<0.05 vs sham group, △△P<0.05 vs model group

3 討論

腦卒中一直是危害人類健康的主要殺手,而缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的 60%～70%,目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。壞死是一種重要的細胞死亡方式,腦缺血后的組織損傷大部分為細胞壞死,主要表現(xiàn)為細胞器水腫、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+升高、ATP含量下降以及細胞器和細胞膜最終破裂[8]。過去認為壞死是不可逆的,不可調(diào)控的,因此,相對于凋亡而言,壞死的研究較少。然而,最近研究表明一種可調(diào)控的細胞壞死,被稱之為程序性壞死,它在病毒感染[9]、心肌缺血[10]和腦缺血再灌注損傷[11]等疾病中都可發(fā)揮重要作用。

3.1 腦缺血后不同時期損傷區(qū)程序性壞死的分布和細胞類型分析

本研究結(jié)果顯示,在腦缺血術(shù)后3d,損傷區(qū)組織染色顯示PI陽性細胞最多,且大部分與NeuN共標,表明在缺血的急性期發(fā)生了以神經(jīng)元為主的程序性壞死;而在腦缺血術(shù)后7d時,PI陽性細胞的數(shù)量明顯減少,主要與GFAP和Iba-1雙標,表明缺血后亞急性期主要壞死的細胞是星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞,這可能與腦缺血后的炎癥反應(yīng)和壞死區(qū)周圍水腫有關(guān)。程序性壞死的發(fā)生是由受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIPK)1和RIPK 3傳遞死亡信號,募集并磷酸化MLKL蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein)形成壞死小體,最終導(dǎo)致細胞死亡,有研究已經(jīng)證實,pMLKL蛋白的膜易位是程序性壞死的最終執(zhí)行者[12]。因此,本研究做了pMLKL的免疫電鏡,結(jié)果顯示,在腦缺血術(shù)后第3天,損傷區(qū)出

圖2 腦缺血后損傷區(qū)壞死的細胞類型分析,免疫熒光染色,×400Fig 2 The types of dead cells in the lesion after cerebral ischemia detected by immunofluorescence,×400A：PI+NeuN (3d);B：PI+GFAP (7d);C：PI+Iba-1 (7d)

圖3 腦缺血后不同時間點損傷區(qū)pMLKL的表達及分布,免疫電鏡,bar=1.0μmFig 3 The distribution of pMLKL in neurons,astrocytes and glial cells of the injured area after cerebral ischemia examined by immuno-electron microscopy,bar=1.0μmA：Neuron (3d);B：Astrocyte (7d);C：Microglia (7d)

現(xiàn)大量的具有壞死特征的細胞,表現(xiàn)為胞膜破裂,染色質(zhì)溶解,細胞器瓦解,pMLKL的膠體金顆粒主要沉積于神經(jīng)元。而在腦缺血術(shù)后第7天 在損傷區(qū)邊緣出現(xiàn)具有壞死特征的細胞,pMLKL的膠體金顆粒分布在星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。這與PI染色及免疫熒光染色結(jié)果一致。

3.2 Nec-1對腦缺血后損傷區(qū)細胞程序性壞死的保護作用

Nec-1為RIPK1的特異性抑制劑,它能將RIPK1的活性片斷鎖定在無活性狀態(tài),從而達到抑制RIPK1的功能活性和程序性壞死形成,并且通過作用于RIPK1和RIPK3的激酶部分,阻斷兩者相互磷酸化,進而抑制RIPK1-RIPK3-MLKL復(fù)合物的形成而發(fā)揮效應(yīng)[13]。本研究免疫印跡結(jié)果顯示,Nec-1給藥組能夠明顯降低腦缺血模型組損傷區(qū)組織pMLKL的表達,這可能與Nec-1通過抑制RIPK1的磷酸化減輕神經(jīng)元的程序性壞死有關(guān),從而減輕缺血性腦卒中引發(fā)的炎癥反應(yīng),減輕周圍組織水腫。綜上所述,腦缺血后損傷區(qū)局部發(fā)生了程序性壞死,在損傷后3d以神經(jīng)元壞死為主,而在5～7d發(fā)生以星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞為主的壞死。因此,在研究腦缺血的治療方案中不僅要抗凋亡,抑制程序性壞死也是至關(guān)重要的,“拮抗壞死”或為腦缺血治療的一個很好的策略。