孫海梅 孫婷怡 楊 姝 吳 波 季鳳清 周德山

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系,北京 100069)

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC),是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Santiago Ramony Cajal于1893年首次在胃腸道中發(fā)現(xiàn)的一類特殊間質(zhì)細(xì)胞,與胃腸道平滑肌和神經(jīng)纖維末梢在解剖學(xué)上有緊密聯(lián)系,具有獨(dú)立功能,既是胃腸起搏細(xì)胞,又具有傳導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的作用[1]。ICC廣泛存在于哺乳動物的整個消化道管壁內(nèi),按分布區(qū)域可大致分為：分布于胃、小腸和結(jié)腸內(nèi)的環(huán)肌與縱行肌之間的肌間神經(jīng)叢ICC;位于黏膜下環(huán)肌層表面的ICC;位于小腸深肌叢區(qū)域的ICC;廣泛散布于環(huán)肌和縱肌肌束內(nèi)的ICC[2]。

目前消化道全層鋪片技術(shù)由于能夠直觀、全面地顯示ICC的分布、形態(tài)以及形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),而成為研究胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要方法之一,但文獻(xiàn)中卻鮮少提及此方法的詳細(xì)操作過程。已知ICC特異性表達(dá)由原癌基因c-kit編碼的受體酪氨酸激酶即c-kit蛋白控制,所以,c-kit蛋白常被用作標(biāo)記ICC[3]。本研究在傳統(tǒng)全層鋪片制作技術(shù)的方法上進(jìn)行摸索和改良,結(jié)合c-kit 免疫熒光染色顯示小鼠胃腸道內(nèi)不同位置ICC的形態(tài),為從事相關(guān)研究的同行提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物

選用C57BL/6J小鼠,8～10周齡,雌雄不限,由首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供(實(shí)驗動物編號AEEI-2016-143)。

1.2 試劑

牛血清白蛋白BSA(中杉金橋生物技術(shù)有限公司);大鼠抗小鼠c-kit單克隆抗體ACK2(1∶200,eBioscience公司);Cy3標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(1∶300,Invitrogen公司)。

1.3 取材固定

小鼠取材前12h禁食。頸椎脫臼法處死小鼠,腹正中切口暴露腹腔,快速取出胃、空腸和結(jié)腸,置于放有4℃預(yù)冷0.01mol/L的PBS的平皿中,用注射器PBS反復(fù)注入胃或腸腔內(nèi)沖洗,以充分去除腔內(nèi)容物,分別待制備冷凍切片和鋪片。

1.4 冷凍切片制備

將沖洗好的胃組織剪成約0.5cm×0.5cm的組織塊,浸入放有OCT的包埋模具中,迅速投入液氮,數(shù)秒后待液氮沸騰停止,取出組織立即放入-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯雍憷湎淅鋬銮衅?切片厚度7μm,APES載玻片貼片,吹干,丙酮固定15min后進(jìn)行染色。

1.5 鋪片制備

將沖洗好的胃腸道組織分別用手術(shù)線結(jié)扎胃賁門端或腸管一端,用注射器將4℃預(yù)冷的丙酮固定液注入胃或腸腔內(nèi),使其維持適當(dāng)充盈狀態(tài),結(jié)扎胃幽門端或腸管另一端,置入丙酮固定液中固定24h(圖1)。制備全層鋪片前去除結(jié)扎部分,將胃沿小彎側(cè)剪開或沿腸系膜緣剪開腸管,取胃體和胃竇的中間1/3部分及腸管制作全層鋪片。于體視解剖顯微鏡下,用鐘表鑷依次剝離黏膜層、黏膜下層,再將環(huán)行平滑肌層與縱行平滑肌分離,并剪成適當(dāng)大小的組織塊,置于0.01mol/L的PBS中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫熒光染色

將制備好的冷凍切片(胃)和全層鋪片(胃、小腸、結(jié)腸)用0.01mol/L 的PBS漂洗5min×3次;1%BSA室溫孵育1h,以降低非特異性染色;棄去多余孵育液,滴加0.1%BSA稀釋的一抗,放置于濕盒內(nèi)4℃過夜;次日,0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,滴加0.1%BSA稀釋的熒光標(biāo)記二抗,濕盒內(nèi)室溫避光孵育1h;0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,染好的鋪片組織用自制鋪片轉(zhuǎn)移托轉(zhuǎn)移到載玻片上,與染好的冷凍切片均用水溶性熒光封片劑封片,于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞為c-kit蛋白陽性的ICC(圖2),應(yīng)用冷凍切片進(jìn)行免疫熒光染色,不能清晰顯示胃壁內(nèi)不同部位ICC形態(tài)。為清晰顯示ICC的形態(tài)結(jié)構(gòu),繼而進(jìn)行全層鋪片的免疫熒光染色(圖3～5),結(jié)果表明,網(wǎng)狀分布于胃(圖3A)、空腸(圖3B)和結(jié)腸(圖3C)的肌間神經(jīng)叢ICC,其胞體呈梭形或星形,細(xì)胞核呈圓形,有2～4個細(xì)長突起,突起反復(fù)分支,彼此間相互連接形成致密復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò);廣泛散布于胃(圖4A)和結(jié)腸(圖4B)的環(huán)縱肌束內(nèi)ICC,其胞體呈梭形,細(xì)胞核橢圓,有2個細(xì)長的突起,走行與細(xì)胞軸長軸一致;位于空腸深肌叢區(qū)域的ICC(圖5A)數(shù)量較少,所形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)較稀疏;位于結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層表面的ICC(圖5B),其胞體形態(tài)不規(guī)則,胞體較大,多個細(xì)長突起交織成獨(dú)立的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

圖1 丙酮充盈的小鼠胃(A)和小腸(B).

圖2 冷凍切片顯示小鼠胃壁內(nèi)ICC,標(biāo)尺=100μm.

圖3 全層鋪片顯示小鼠胃(A)、空腸(B)、結(jié)腸(C)肌間神經(jīng)叢ICC,標(biāo)尺=100μm.

圖4 全層鋪片顯示小鼠胃(A)、結(jié)腸(B)環(huán)縱肌束內(nèi)ICC,標(biāo)尺=100μm.

圖5 全層鋪片顯示小鼠空腸深肌叢ICC(A)、結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層表面ICC(B),標(biāo)尺=100μm.

3 討論

切片技術(shù)是形態(tài)學(xué)研究的傳統(tǒng)、經(jīng)典實(shí)驗技術(shù),但存在一定的局限性,很難客觀反映某些器官、組織或細(xì)胞的全貌。比如分布于消化管道的腸神經(jīng)系統(tǒng),因其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特殊性,難以應(yīng)用普通切片從某一斷面觀察神經(jīng)細(xì)胞[4]。全層鋪片技術(shù)早期一般應(yīng)用于虹膜、腸系膜、小血管等較薄的膜狀組織的制片,而對于較厚的組織少有應(yīng)用。本實(shí)驗將消化道全層鋪片技術(shù)用于顯示胃腸道不同部位ICC,染色結(jié)果證實(shí)該方法較切片具有明顯優(yōu)勢,能夠直接暴露肌內(nèi)、肌間ICC,從而完整觀察其形態(tài)和分布,并能直觀顯示ICC的細(xì)胞密度和所形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

以往文獻(xiàn)雖然對多種實(shí)驗動物的ICC顯示方法進(jìn)行過研究,但缺乏對鋪片制作過程及注意事項的詳細(xì)介紹,同時鮮見對小鼠消化道不同部位ICC鋪片染色對比觀察的研究。本實(shí)驗在不斷改進(jìn)鋪片制作技術(shù)的過程中,總結(jié)了如下鋪片技術(shù)的關(guān)鍵要點(diǎn)：(1) 由于組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),取材時不同器官或同一器官不同部位對于制作好的鋪片標(biāo)本有一定影響,如與胃竇相比,胃底和胃體更易鋪片,靠近胃大彎側(cè)要比胃小彎側(cè)容易鋪片,小腸近回盲部的位置最易鋪片;(2) 取材時需要對胃腸道進(jìn)行充分地充盈固定,有助于腔壁的肌層變薄,易于染色,且成片后效果較好;(3) 制作鋪片標(biāo)本是在解剖顯微鏡下的精細(xì)操作,所以選擇尖細(xì)的進(jìn)口鐘表鑷有助于精準(zhǔn)地分離組織。

本研究通過應(yīng)用全層鋪片技術(shù),結(jié)合免疫熒光染色,并運(yùn)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,能夠清晰、全面的顯示胃腸道各部位ICC的形態(tài)和密度,精確度較高,可以為實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性打下良好基礎(chǔ),并對深入研究ICC與胃腸運(yùn)動以及相關(guān)疾病的關(guān)系具有重要意義。