李 容 呂國(guó)榮△ 王凌星

(1 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,泉州 362000)

微波技術(shù)的迅猛發(fā)展應(yīng)用,使得微波輻射已日益成為威脅人類健康的環(huán)境因素之一。現(xiàn)最廣泛使用的全球通數(shù)字手機(jī),其工作時(shí)的中心頻率為900MHz,屬于微波(300MHz～300GHz)范疇。人們對(duì)手機(jī)已產(chǎn)生強(qiáng)烈依賴,孕婦也不例外,但其對(duì)仔代長(zhǎng)期潛在的效應(yīng)卻不容忽視。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)手機(jī)輻射敏感[1],而腦前額葉皮質(zhì)功能與認(rèn)知[2]、情緒[3]、疼痛[4]和行為管理[5]等相關(guān)。5-羥色胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),5-羥色胺2A受體(5-hydroxytryptamine 2A receptor,5-HT2AR)是5-羥色胺受體的一個(gè)亞型,其與精神分裂癥[6]、抑郁睡眠障礙[7]、注意力缺陷多動(dòng)癥[8]等的發(fā)病機(jī)制相關(guān)?，F(xiàn)有研究報(bào)道微波輻射對(duì)前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR的表達(dá)影響尚不清楚,故本研究旨在通過(guò)對(duì)孕期手機(jī)輻射暴露的仔鼠腦前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR的檢測(cè),為客觀評(píng)價(jià)孕期手機(jī)輻射暴露風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及處理

48只SD成年大鼠雌、雄各24只,體質(zhì)量(296.00±13.15) g,參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行交配。輻射條件[10]：24只孕鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組(常規(guī)飼養(yǎng))、低劑量輻射組(21d,6h/d)和高劑量輻射組(21d,24h/d),每組8只。手機(jī)置于籠頂內(nèi)面正中(持續(xù)充電)處于通話狀態(tài),鼠自由活動(dòng)于籠中;手機(jī)(SM-G3608)：900MHz,比吸收率(SAR)最大值為0.513W/kg。各組仔鼠分別隨機(jī)留養(yǎng)64只(出生后第21天斷乳),分別于出生后第1、7、30、60天取前額葉皮質(zhì)待檢。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)5-HT2AR的表達(dá)

各組在各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取出8只仔鼠,在水合氯醛(4%)腹腔注射麻醉下參照文獻(xiàn)[11-12]取前額葉皮質(zhì)、固定,待檢。實(shí)驗(yàn)步驟：(1) 切片,5μm;(2) 脫蠟至水;(3) 熱修復(fù)抗原;(4) 滅活內(nèi)源性酶;(5) 孵育5-HT2AR一抗(1∶300，Abcam,USA),陰性對(duì)照未加一抗(用PBS替代一抗),4℃過(guò)夜;(6) 孵育二抗：洗片,滴加50μl HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶200，Abcam,USA),37℃孵育30min;(7) DAB顯色;(8) 蘇木精復(fù)染,蒸餾水沖洗,PBS返藍(lán);(9) 各級(jí)乙醇脫水后置于二甲苯(10min,2次)封片,顯微鏡下觀察拍照(曝光時(shí)間為1.78ms,長(zhǎng)寬比16∶10)。陽(yáng)性表達(dá)為黃色或棕黃色,每只仔鼠前額葉皮質(zhì)相應(yīng)部位取3片采用IPP(Image-Pro-Plus)軟件,對(duì)照片隨機(jī)(3×8)視野進(jìn)行IOD值分析。

1.3 Real-time熒光PCR檢測(cè)5-HT2AR mRNA的相對(duì)表達(dá)

各組在各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取出8只仔鼠,在水合氯醛(4%)腹腔注射麻醉下,參照文獻(xiàn)[13]取腦前額葉皮質(zhì),液氮速凍,采用TRIzol提取總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR法進(jìn)行RT-qPCR,引物設(shè)計(jì)是在NCBI上搜索目的基因的序列,運(yùn)用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工合成,β-actin-引物正義序列5′-CA TCCTGCGTCTGG ACCTGG-3′,反義序列為5′-TA ATGTCACGCACGATTTCC-3′,product length：107bp;5HT2AR-正義序列為5′-AACGGTCCATCCACAG AGAG,5HT2AR-3′,反義序列為5′-ATGGGCACCAC ATTACAACA-3′,product length：129bp，結(jié)果以常規(guī)2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平來(lái)整理分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 5-HT2AR在仔鼠前額葉皮質(zhì)中的表達(dá)

棕色陽(yáng)性表達(dá)為5-HT2AR分布,緊貼細(xì)胞核或以細(xì)胞核為中心呈環(huán)形和星形分布。隨出生后的時(shí)間推移,以1d(圖1A、B、C)、7d(圖1D、E、F)、30d(圖1G、H、I)和60d(圖1J、K、L)為序,在同等放大倍數(shù)視野下,可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞也依次逐漸增大。目測(cè)輻射組(圖1B、C、E、F、H、I、K、L)的陽(yáng)性表達(dá)比同期空白對(duì)照組(圖1A、D、G、J)的陽(yáng)性表達(dá)面積少且強(qiáng)度降低(圖1)。

圖1 5-HT2AR在仔鼠腦前額葉皮質(zhì)中的表達(dá)，免疫組組織化學(xué)顯色,bar=50μmFig 1 Expression of 5-HT2AR in the prefrontal cortex of offspring rats,immunochemical staining,bar=50μm A-C：One day after birth;D-F：Seven days after birth;G-I：Thirty days after birth;J-L: Sixty days after birth; A,D,G,J：Blank control group;B,E,H,K：Low-dose radiation group;C,F,I,K：High-dose radiation group

2.2 5-HT2AR陽(yáng)性表達(dá)的IOD值

與空白對(duì)照組相比,兩個(gè)輻射組陽(yáng)性表達(dá)的IOD值顯著降低(P<0.05);高劑量輻射組IOD值顯著低于低劑量輻射組(表1,P<0.05)。

表1 仔鼠腦前額葉皮質(zhì)5-HT2AR陽(yáng)性表達(dá)IOD值Tab 1 Positive expression of 5-HT2AR IOD in the prefrontal cortex of offspring rats (n=24,

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vslow-dose radiation group

2.3 仔鼠腦前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR mRNA相對(duì)表達(dá)水平

表2 仔鼠腦前額葉皮質(zhì)5-HT2AR mRNA相對(duì)表達(dá)水平Tab 2 Relative expression of 5-HT2AR mRNA in the prefrontal cortex of offspring rats (n=3,

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vslow-dose radiation group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)仔鼠取材設(shè)計(jì)了4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)：1d(新生兒期)、7d(哺乳期)、30d(兒童期)和60d(青少年前期),旨在觀察孕期微波輻射暴露對(duì)仔鼠在這幾個(gè)典型階段的前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR表達(dá)的影響。進(jìn)入青春期(60d)后,探討分析時(shí)就需考慮性別差異,以期在以后的實(shí)驗(yàn)研究中能進(jìn)一步開(kāi)展。

免疫組織化學(xué)顯色顯示,由于新生鼠(出生后第1天)腦體積小且脆性大,造成了取前額葉皮質(zhì)和切片時(shí)難度增大。隨著出生后的時(shí)間推移,神經(jīng)細(xì)胞也在逐步發(fā)育長(zhǎng)大(如圖所示：B→E→H→K)。在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí),是對(duì)同期的各組分析比較,以期推測(cè)孕期微波輻射暴露對(duì)仔鼠的影響。利用圖像分析軟件對(duì)400倍視野下棕色陽(yáng)性進(jìn)行IOD值分析,結(jié)果顯示2個(gè)輻射組的IOD值顯著低于同期的空白對(duì)照組,且高劑量輻射組顯著低于低劑量輻射組,此結(jié)果表明孕期微波輻射暴露可顯著降低仔鼠腦前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR 的表達(dá)水平。Real-time熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。而目前未見(jiàn)涉及孕鼠微波輻射暴露對(duì)仔鼠腦前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR表達(dá)情況的報(bào)道,已有的多是從基因水平[14]或是從其拮抗體[15]研究著手,由此來(lái)探討發(fā)病生現(xiàn)機(jī)制與前額葉皮質(zhì)中5-HT2AR的相關(guān)性。

綜上,孕期手機(jī)輻射暴露下調(diào)了仔鼠腦前額葉皮質(zhì)5-HT2AR的表達(dá)水平,此結(jié)果為客觀評(píng)估孕期微波輻射暴露風(fēng)險(xiǎn)提供了依據(jù)和參考。