王 瑾 楊東偉 李海洲

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院,1 心血管內(nèi)科四病區(qū),2 心內(nèi)科三病區(qū)，鄭州 450000)

許多因素都會引發(fā)心肌炎,如病毒感染、心臟毒素、藥物過敏和風(fēng)濕病等[1-2]。心肌炎是造成青少年心臟性猝死和擴(kuò)張型心肌病的主要原因之一,也是導(dǎo)致胸痛、呼吸困難、心悸的重要原因[3-4]。越來越多的研究表明,許多天然產(chǎn)物在心肌炎的治療中發(fā)揮著積極作用[5-6]。銀杏葉提取物作為一種治療與年齡相關(guān)的記憶缺陷的中藥已具有數(shù)百年的歷史,近年來發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物在抗炎、抗癌及抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用[7]。銀杏內(nèi)脂B是銀杏葉的主要活性物質(zhì)之一,屬于二萜類物質(zhì)。大量數(shù)據(jù)表明銀杏內(nèi)脂B有利于缺血性中風(fēng)、糖尿病內(nèi)皮功能紊亂和脊髓損傷等疾病的治療[8-10]。本研究旨在探索銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素 (endotoxin,Ex) 誘導(dǎo)的心肌損傷、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物和主要試劑

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)來源于Sigma公司,貨號與規(guī)格為L3012-25mg;銀杏內(nèi)脂B來源于Sigma-Aldrich,HPLC≥90%,貨號與規(guī)格為G6910-50mg。

蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin,H-E)染色液(G1120)購自北京索萊寶有限公司。心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin,cTnⅠ)ELISA檢測試劑盒(69-57623)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH) ELISA檢測試劑盒(MSK,59-20039)。肌紅蛋白(myoglobin,Mb) ELISA檢測試劑盒(69-20199)。肌酸激酶同工酶(creatine phosphokinase isoenzyme,CK-MB)ELISA檢測試劑盒(69-79625)。ELISA白細(xì)胞介素(interleukin)-6 ELISA檢測試劑盒(69-99854)。IL-1β的ELISA檢測試劑盒(MSK,69-59812)購自默沙克生物科技有限公司。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)ELISA檢測試劑盒(Beyotime,PT512)購自碧云天生物有限公司。抗caspase-3(ab13847)抗體、抗Bcl-2(ab59348)抗體、?？笲ax(ab216494)抗體、抗NF-κB P65(ab207297)抗體、抗p-NF-κB P65(ab222494)抗體購自Abcam公司。

1.2 動物及分租

24只C57BL/10小鼠由中國科學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠隨機分為4組：對照組(Ctrl)、銀杏內(nèi)脂B(GB)組、內(nèi)毒素(Ex)組、內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B(Ex+GB)組。首先內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組一次性腹腔注射LPS (10mg/kg),對照組和銀杏內(nèi)脂B組用生理鹽水代替LPS。然后銀杏內(nèi)脂B組和內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組每天進(jìn)行腹腔注銀杏內(nèi)脂B(100mg·kg-1·d-1),連續(xù)注射9d。對照組和內(nèi)毒素組用生理鹽水代替銀杏內(nèi)脂B進(jìn)行注射。

1.3 H-E染色檢測各組小鼠心肌組織病變情況

頸椎脫臼法處死小鼠后取左心室心肌組織用4%的多聚甲醛在4℃下固定24h。PBS清洗3次,再用30%、50%和70%的乙醇依次脫水10min。去除乙醇脫水機中脫水,經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行切片。按照H-E染色液說明書進(jìn)行H-E染色。光鏡下觀察心肌組織病變情況。

1.4 ELISA檢測心肌損傷因子水平

收集各組小鼠血清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。首先樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育30min,洗滌后加入酶標(biāo)試劑37℃反應(yīng)30min。再加顯色試劑37℃避光顯色15min。加終止液終止反應(yīng)后450nm處檢測各個反應(yīng)孔測吸光值。

1.5 免疫印跡檢測心肌損傷因子的蛋白表達(dá)

向待測組織細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取,100℃變性5min后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的BSA封閉1h后加入相應(yīng)的一抗,4℃過夜孵育。第2天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,兩兩比較用獨立的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)脂B可改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌組織病變

H-E染色觀察銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌組織病變的影響。結(jié)果顯示(圖1),對照組和銀杏內(nèi)脂B組細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)均勻,排列整理有序,無斷裂;內(nèi)毒素組細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核增大,排列紊亂,橫紋不清。內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常,排列規(guī)則,無斷裂。由此可見,銀杏內(nèi)脂B可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌組織病變。

圖1 H-E染色觀察心肌組織病變,×200Fig 1 The pathological changes of myocardial tissues were observed by H-E staining,×200A: Ctrl group;B: GB group;C: Ex group;D: Ex+GB group

2.2 銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌損傷標(biāo)記蛋白的升高

通過ELISA檢測心肌損傷標(biāo)記蛋白cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH蛋白水平,分析銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌損傷的影響。結(jié)果(圖2)顯示,內(nèi)毒素組cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH水平明顯高于對照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組cTnⅠ、 Mb、 CK-MB和LDH水平明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明,銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌損傷標(biāo)記蛋白cTnⅠ、 Mb、 CK-MB和LDH水平的升高,減弱心肌損傷。

2.3 銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為分析銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠細(xì)胞凋亡的影響,免疫印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果(圖3)顯示,內(nèi)毒

圖2 ELISA檢測心肌損傷標(biāo)記物蛋白水平Fig 2 The protein levels of myocardial injury marker were tested by ELISA*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs experimental group

素組caspase-3和Bax表達(dá)明顯高于對照組,Bcl-2表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組caspase-3和Bax表達(dá)明顯降低,Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)。由此可見,銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠caspase-3和Bax表達(dá)的上升和Bcl-2表達(dá)的下降,降低細(xì)胞凋亡。

圖3 免疫印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 3 The expression of apoptosis related peoteins were detected by Western blotting*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

2.4 銀杏內(nèi)脂B可減弱內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)的增強

利用ELISA檢測促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,分析銀杏內(nèi)脂B對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示(圖4),內(nèi)毒素組TNF-α、IL-6 和IL-1β水平明顯高于對照組(P<0.05)。銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1β水平的升高(P<0.05)。以上結(jié)果說明,銀杏內(nèi)脂B可減弱內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)的增強。

圖4 ELISA檢測炎癥因子Fig 4 The levels of inflammatory factors were measured by ELISA*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

2.5 銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化的上升

為進(jìn)一步探究銀杏內(nèi)脂B影響內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠的分子機制,免疫印跡檢測NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白水平。結(jié)果顯示(圖5),NF-κB P65蛋白水平無明顯變化,內(nèi)毒素組p-NF-κB P65蛋白水平最高。內(nèi)毒素組p-P65/P65比值明顯高于對照組(P<0.05)。內(nèi)毒素+銀杏內(nèi)脂B組p-P65/P65比值明顯低于內(nèi)毒素組(P<0.05)。上述結(jié)果表明,銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化的上升。

3 討論

目前對心肌炎的治療方法分為藥物療法、免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制及抗病毒治療等。藥物療法是心肌炎的主要治療手段,所用藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,醛固酮拮抗劑及卡維地洛等[11]。許多天然產(chǎn)物由于具有抗病毒、抗炎及抗癌等生物活性而受到越來越

圖5 免疫印跡檢測NF-κB P65磷酸化水平Fig 5 The phosphorylation levels of NF-κB P65 were tested by Western blotting*P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs experimental group

多的關(guān)注[12-14]。大量文獻(xiàn)報道各種各樣的天然產(chǎn)物具有減輕心肌組織病變的功效。Lim等[15]報道尾葉香茶菜提取物OR12可改善柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的小鼠心肌組織損傷。有數(shù)據(jù)表明小檗堿可減輕自身免疫性心肌炎大鼠心肌纖維紊亂等心肌炎病變[16]。另外,長蒴黃麻葉提取物可改善三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌炎大鼠心肌組織損傷[17]。本研究結(jié)果顯示,銀杏內(nèi)脂B可改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核增大,排列紊亂等,這些結(jié)果表明銀杏內(nèi)脂B可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠心肌組織病變。

研究表明許多天然產(chǎn)物可以逆轉(zhuǎn)各種疾病中心肌損傷標(biāo)記物水平的變化。據(jù)報道紅景天苷可降低LPS誘導(dǎo)的心肌炎大鼠CK-MB和LDH的釋放[18]。Gui等[19]報道黃芪甲苷Ⅳ可抑制CK-MB和cTnⅠ水平的升高。有數(shù)據(jù)顯示銀杏內(nèi)脂B可減弱缺血再灌注大鼠LDH水平的升高[20-21]。本研究結(jié)果表明,在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠中,銀杏內(nèi)脂B可抑制cTnⅠ、 Mb、CK-MB和LDH水平的升高,減輕心肌損傷。

大量研究表明天然產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著積極作用。Mito等[22]報道姜黃素可降低急性心肌炎大鼠細(xì)胞凋亡的增加,抑制caspase-3和caspase-7表達(dá)的增強。據(jù)報道銀杏內(nèi)脂B具有降低高海拔導(dǎo)致的腦水腫大鼠caspase-3表達(dá)上升的功能[23]。在急性脊髓損傷大鼠中,銀杏內(nèi)脂B可提高Bcl-2/Bax相對表達(dá)量比值,抑制caspase-3表達(dá)的增強[24]。此外,銀杏內(nèi)脂B還可減弱阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠caspase-3和Bax表達(dá)的增強和Bcl-2表達(dá)的下降[25]。本研究結(jié)果顯示,銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠caspase-3和Bax表達(dá)的上升和Bcl-2表達(dá)的下降,減弱細(xì)胞凋亡。

炎癥反應(yīng)的增強是多種疾病的常見病癥。很多天然產(chǎn)物都具有抗炎的作用。據(jù)報道芹黃素可抑制自身免疫性心肌炎小鼠促炎因子INF-γ、 TNF-α和IL-2水平的升高[26]。在柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的心肌炎小鼠中,三七總皂苷可降低TNF-α和IL-6水平的上升[27]。有數(shù)據(jù)顯示,銀杏內(nèi)脂B可減弱堿燒傷誘導(dǎo)的小鼠角膜IL-6和IL-1β的表達(dá)的增強[28]。本研究結(jié)果表明,銀杏內(nèi)脂B可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌炎小鼠TNF-α、IL-6 和IL-1β水平的升高,降低炎癥反應(yīng)。

NF-κB通路在各種細(xì)胞進(jìn)程中起著重要作用,許多天然產(chǎn)物都可以影響NF-κB通路活化。據(jù)報道姜黃素可通過抑制NF-κB通路減輕柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的小鼠心肌炎損傷[29]。Zempo等[30]報道可可多酚可減弱自身免疫性心肌炎小鼠NF-κB P65磷酸化水平的升高。銀杏內(nèi)脂B可通過抑制NF-κB P65磷酸化水平的上升減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[31]。本研究結(jié)果顯示,銀杏內(nèi)脂B可通過抑制NF-κB P65磷酸化減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠心肌炎損傷，為心肌炎的治療提供了理論依據(jù)。