劉 璐 李 丹 劉 囡 張 卓 高 超 李洪鵬

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院解剖學教研室,沈陽 110013)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由外力引起的腦挫傷而導致神經(jīng)功能障礙[1]。TBI最初會引起機械性損傷，而后會造成繼發(fā)性損傷，例如氧化應激[2]。盡管TBI發(fā)生后可以通過手術(shù)，診斷技術(shù)來預防處理，但目前沒有有效的藥物能夠治療由繼發(fā)性腦損傷造成的神經(jīng)損傷[3]。TBI引起的繼發(fā)性損傷中氧化應激占據(jù)重要位置[4]，而核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路在抗氧化方面起著核心作用。在基礎情況下，Nrf2定位在細胞質(zhì)并被它的抑制劑kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)固定[5]。在氧化應激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1分離，通過和抗氧化反應原件ARE反應，遷移入核并參與調(diào)解抗氧化基因的表達，如血紅素加氧酶(Heme oxygenase-1，HO-1)[5]。據(jù)研究星形膠質(zhì)細胞對TBI后的組織修復和突觸重塑有作用，并能減輕TBI造成的后遺癥[6]。在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)的模型中發(fā)現(xiàn)顯示，Nrf2主要在星形膠質(zhì)細胞中表達，而且會促進下游蛋白HO-1等抗氧化酶表達，抵抗氧化應激，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[7]。本研究以黑質(zhì)紋狀體通路損傷為模型探究創(chuàng)傷性腦損傷后Nrf2在星形膠質(zhì)細胞中的表達情況，進而了解膠質(zhì)細胞與Nrf2信號通路的關(guān)系，為神經(jīng)功能恢復提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級4～5周雄性昆明(KM)小鼠,25～30g,將小鼠隨機分為組：假手術(shù)組(sham組),TBI后1d組,4d 組,7d組,每組12只,其中6只用于免疫熒光染色等形態(tài)學觀察,6只用于制作免疫印跡檢測。腦損傷后會出現(xiàn)部分小鼠死亡,將按計劃數(shù)量進行補充。

1.2 模型制備及取材

創(chuàng)傷性腦損傷的模型為黑質(zhì)紋狀體通路損傷[8]。稱量小鼠體質(zhì)量,按照體質(zhì)量(0.03ml/10g)行腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉,剪毛后固定于腦立體定位儀(成都泰盟)上。以門齒低于耳桿3mm為標準進行固定,將長為2mm的切刀固定于立體定位儀上。消毒后剪開頭皮,去除頂骨骨膜,找到前囟點,在顱骨中線右側(cè)0.5mm,前囟點后方1.5mm處標記,用骨鉆鉆開一個長為2mm的長方形開口,暴露大腦。在標記處插入切刀,深度約5.5mm。最后緩慢拔出切刀,時刻關(guān)注小鼠呼吸,棉球止血后進行縫合。假手術(shù)組只暴露顱骨。損傷后1、4、7d各組進行灌流取材。每組進行免疫印跡檢測的小鼠經(jīng)心灌流0.9% Nacl后斷頭取出新鮮腦組織,-80℃儲存,以備進行后續(xù)蛋白濃度檢測實驗。進行免疫熒光染色的小鼠先經(jīng)心臟灌流0.9% Nacl后,繼續(xù)用4%多聚甲醛心臟灌流固定后取出腦組織,再放入4%多聚甲醛中固定過夜。然后將腦組織轉(zhuǎn)入到30%蔗糖溶液中進行沉糖1～2d直至腦組織沉底。再經(jīng)冰凍切片機(德國萊卡)切片為10μm厚的水平腦組織切片,-20℃儲存,以備免疫熒光染色實驗。

1.3 免疫印跡檢測

以新鮮腦組織損傷處為中心,取其上下1mm的組織,重0.07～0.09g之間,加入1ml生理鹽水置于冰上進行剪碎,離心,倒掉含有血液的生理鹽水,繼續(xù)加入1ml生理鹽水剪碎,離心。重復此操作,直到將血液去除干凈。按比例加入RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司),蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物技術(shù)公司)和磷酸酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)公司)。再經(jīng)過超生粉碎機粉碎后靜置于冰上30min,12000r/min 4℃離心30min,取上清液。按BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)說明書將樣品加入96孔板進行蛋白濃度的測定,以蛋白質(zhì)量為30μg/50μg除以濃度計算出所需要的體積。每次上樣量為10μl,減去所求出的樣品體積,其余用loading和PBS補齊;再將樣品放入100℃5min,分裝后存放于-80℃。SDS-PAGE凝膠試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)配制10%濃度分離膠,5%濃縮膠,蛋白上樣量為10μl,Bio-Rad電泳儀進行電泳,80V濃縮膠,120V分離膠至分離膠底部。取出凝膠后使用Bio-Rad免疫印跡濕轉(zhuǎn)法,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore),5%BSA進行37℃封閉1h,然后洗膜3次,加入所需一抗4℃過夜,所有一抗都使用1%BSA配制。所需一抗有Rabbit anti-Nrf2(美國Proteintech公司,1∶1000),Rabbit anti-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP) (Abcam Cambridge,UK,1∶3000),Rabbit anti-GAPDH (Abcam Cambridge,UK,1∶5000)。次日洗膜3次,加入HRP標記山羊抗兔(美國Proteintech公司,1∶5000)于37℃恒溫箱孵育90min。避光配制ECL發(fā)光液,發(fā)光觀察條帶。應用Image J進行灰度值分析,Nrf2,GAPDH與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值可作為Nrf2的表達量。

1.4 免疫熒光染色法

-20℃取出切片室溫放置15min,PBS洗3次,每次5min,加入Triton X-100進行透膜10min,PBS洗3次,每次5min,后用1%BSA于37℃孵育30min,擦干封閉液,加入由PBS配制的Rabbit anti-Nrf2(美國Proteintech公司,1∶100)和Chick anti-GFAP(美國Millipore,1∶500)一抗混合液,4℃過夜。次日PBS洗3次,每次3min,在暗室中配制并加入由FITC 488 (Invitrogen,Goat anti-Rabbit,1∶100)和cy3(Invitrogen,anti-Chick 1∶200)制成的二抗混合液后于37℃孵育1h。取出后在暗室中PBS洗3次,每次10min,加入DAPI 3～5min,PBS洗3次,每次10min,加入抗熒光淬滅劑進行封片,使用熒光顯微鏡(Nikon,ECLIPSE 80i,日本)觀察腦片,CCD Spot camera將圖片進行采集,后由Adobe Photoshop CS6將圖片進行處理修整。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷性腦損傷后各時間點Nrf2和GFAP的表達

免疫印跡結(jié)果顯示(圖1A)，與假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷性腦損傷1d時Nrf2表達開始上升，4d達到高峰，但7d時有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，星形膠質(zhì)細胞標志物-GFAP損傷后1d時(P<0.05)、4d時(P<0.01)升高；與損傷后1d組相比，損傷后4d時(P<0.05)升高；與損傷后4d組相比，損傷后7d時下降(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1B)。

圖1 創(chuàng)傷性腦損傷后Nrf2、GFAP蛋白的表達Fig 1 The expression of Nrf2,GFAP protein after traumatic brain injuryA：The expression of Nrf2 and GFAP protein by Western blotting; B：The integrate option density of Nrf2 and GFAP/GAPDH.*P<0.05,**P<0.01 vs sham;#P<0.05 vs the 1d group;△P<0.05 vs the 4d group

2.2 創(chuàng)傷性腦損傷后Nrf2在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的定位表達

Nrf2(綠色)、GFAP(紅色)、細胞核(藍色)免疫熒光雙標染色法結(jié)果顯示,在假手術(shù)組中(圖2A～2D),Nrf2呈現(xiàn)出陰性表達或表達較弱,細胞質(zhì)有少量表達,未見在核內(nèi)有表達;損傷后(圖2),Nrf2的陽性表達明顯升高,損傷1d時Nrf2在細胞質(zhì)和細胞核均有表達,4d時入核明顯,在細胞核中的表達顯著增高。

圖2 假手術(shù)組(2A～2D),損傷后1d組(3A～3D)、4d組(4A～4D)和7d組(5A～5D)中Nrf2在星形膠質(zhì)細胞中的表達,×40Fig 2 The expression of Nrf2 in astrocytes at the sham group (2A-2D),the 1d group after brain injury (3A-3D), the 4d group after brain injury (4A-4D),the 7d group after brain injury (5A-5D),×40A：DAPI staining； B：Nrf2 staining； C：Location of Nrf2 in nucleus； D：Overlapping for Fig A,Fig B and Fig C

3 討論

本研究通過應用黑質(zhì)紋狀體通路損傷模型模擬創(chuàng)傷性腦損傷,免疫印跡結(jié)果顯示損傷后1h損傷周圍組織中Nrf2表達增加,4d時表達達到高峰,7d時有所減少。免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示損傷后1d,Nrf2表達升高且定位在細胞核中;4d時,在細胞質(zhì)和細胞核中陽性表達均有顯著增加,且入核效果顯著;7d時表達有所減弱。由此推斷可能是Nrf2信號通路活化后進而激活下游的Ⅱ相解毒酶發(fā)揮了抗氧化作用。

星形膠質(zhì)細胞廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,它能夠支持神經(jīng)元遷移并能為神經(jīng)元提供營養(yǎng),參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復和再生。但腦損傷后星形膠質(zhì)細胞會發(fā)生增殖活化[9],活化形成的反應性星形膠質(zhì)細胞可分泌炎癥因子阻礙神經(jīng)功能恢復[10]。近年來,Nrf2作為細胞抗氧化反應的一個重要組成部分受到越來越多的關(guān)注[5],且Nrf2已被證明在多種病理過程中扮演一種保護性分子的角色[11]。Nrf2的活化能夠防止過多的氧自由基損傷腦組織[12]。研究表明Nrf2在腦損傷中起到神經(jīng)保護作用[13],且Nrf2敲除后可導致小鼠腦損傷加重[14]。多種腦保護藥物的應用是建立在通過激活Nrf2來減輕腦損傷的依據(jù)之上[15-18],其神經(jīng)保護機制主要在于減少腦水腫,抑制氧化應激、細胞凋亡、炎癥和保護血腦屏障[5]。

本實驗結(jié)果表明創(chuàng)傷性腦損傷能使Nrf2,GFAP表達增加,其中GFAP在1d時增加即有統(tǒng)計學意義,Nrf2在損傷后4d時增加有統(tǒng)計學意義。損傷后Nrf2會定位表達在星形膠質(zhì)細胞,且在4d時入核表達明顯;7d時星形膠質(zhì)細胞活化表達降低說明Nrf2入核后引起相應的信號通路活化,激活下游的Ⅱ相解毒酶發(fā)揮了抗氧化作用。而具體作用機制還需要進一步探究。