殷文浩，金夢(mèng)祝，丁韌燁

（嘉興市第一醫(yī)院，浙江 嘉興 314001）

銀屑病的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，研究表明顯微血管變化與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)，血管生成因子已成為銀屑病的研究熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一[1]，肝素酶（Heparanase，HPA）能降解基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)，直接參與血管的生成[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)患者血清HPA和VEGF水平，探討二者在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2015年1月—2016年12月我院皮膚科門(mén)診尋常型銀屑病患者90例，均具有典型的臨床表現(xiàn)。近3個(gè)月未服用過(guò)維A酸、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物，1個(gè)月內(nèi)未用過(guò)治療銀屑病的內(nèi)服及外用藥物，排除自身免疫性疾病及其他嚴(yán)重慢性系統(tǒng)性疾病。其中男49例，女41例，年齡24～57歲，平均（39.93±6.90）歲，進(jìn)行期 57例，靜止期 33例。病情嚴(yán)重程度按照銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）積分法[4]評(píng)分。另取60例正常人作為對(duì)照組，其中男32例，女 28例，年齡26～58歲，平均（41.75±6.05）歲。2組的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 HPA ELISA試劑盒為美國(guó)BIM公司產(chǎn)品，VEGF ELISA試劑盒為上?，庬嵣锟萍加邢薰井a(chǎn)品。ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

1.2.2 方法 抽取尋常型銀屑病患者和正常對(duì)照者外周靜脈血，離心，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），具體操作嚴(yán)格按照HPA和VEGF試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HPA水平檢測(cè)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為2 000、1 000、500、250、125、62.5 pg/mL，20×洗滌緩沖液按 1∶20用蒸餾水稀釋；從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔加入待測(cè)樣本50 μL；標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱內(nèi)孵育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μL），靜置 1 min，如此反復(fù)洗滌5次后棄去洗滌液；每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各樣本濃度，單位為pg/mL。VEGF的檢測(cè)方法基本相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，各組間比較采用 t檢驗(yàn)；HPA 和VEGF水平與PASI評(píng)分之間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血清HPA和VEGF水平比較 銀屑病組HPA和VEGF水平均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 2組血清HPA和VEGF水平比較 （±s）

表1 2組血清HPA和VEGF水平比較 （±s）

組別 n 血清H P A水平（p g/m L） 血清V E G F水平（p g/m L）對(duì)照組 6 0 3 8 5.2 5±9 3.6 1 1 1 9.7 0±2 7.1 7銀屑病組 9 0 6 5 1.4 3±1 4 0.7 6 2 5 4.6 7±6 3.2 0 t-1 3.9 1 0 -1 7.9 2 7 P 0.0 0 0 0.0 0 0

2.2 進(jìn)行期與靜止期血清HPA和VEGF水平比較進(jìn)行期患者血清HPA和VEGF水平均顯著高于靜止期患者（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 進(jìn)行期與靜止期血清HPA和VEGF水平比較 （±s）

表2 進(jìn)行期與靜止期血清HPA和VEGF水平比較 （±s）

分期 n 血清H P A水平（p g/m L） 血清V E G F水平（p g/m L）進(jìn)行期 5 7 6 8 1.0 3±1 3 9.1 5 2 6 8.3 5±6 5.0 0靜止期 3 3 6 0 0.3 1±1 3 0.2 4 2 3 1.0 3±5 2.9 5 t 2.7 1 4 2.8 0 2 P 0.0 0 8 0.0 0 6

2.3 尋常型銀屑病患者血清HPA和VEGF水平與PASI評(píng)分的關(guān)系 尋常型銀屑病患者血清HPA和VEGF水平均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.770 與 0.675（P<0.05）。見(jiàn)表 3。

表3 尋常型銀屑病患者血清HPA和VEGF水平與PASI評(píng)分的關(guān)系

3 討論

銀屑病最早發(fā)生的病理改變即是血管的形成和分布變化，表現(xiàn)為真皮乳頭層毛細(xì)血管擴(kuò)張、迂曲、滲透性增加和內(nèi)皮細(xì)胞增生。據(jù)報(bào)道，銀屑病患者皮損比非皮損部位的真皮乳頭層血管內(nèi)皮面積大4倍，甚至在銀屑病患者非皮損皮膚中也常能見(jiàn)到異常擴(kuò)張的血管[5]。微血管變化在銀屑病中出現(xiàn)最早、消失最晚、貫穿始終，與銀屑病的發(fā)生發(fā)展、持續(xù)存在及復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。血管因子的研究為銀屑病的臨床診治提供了新的思路。

VEGF作為“經(jīng)典”的促血管生成因子，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體，激活受體的酪氨酸激酶，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與血管的新生和遷移[6]。VEGF還對(duì)炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞有化學(xué)趨化作用，是連接血管新生和炎癥的關(guān)鍵性因子[7]。VEGF抑制劑包括單克隆抗體、受體拮抗劑、酪氨酸酶激酶抑制劑三大類，雖然相關(guān)藥物還未被批準(zhǔn)用于臨床治療銀屑病，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明他們對(duì)銀屑病有潛在的治療作用，仍有待深入研究和推廣[8]。

血管生成的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和組織重塑，在銀屑病領(lǐng)域研究較多,但MMP的功能比想象中的復(fù)雜得多，大規(guī)模抑制可能產(chǎn)生不良后果，且MMP的異構(gòu)體有28種之多[9]，很難獲得針對(duì)特定催化靶點(diǎn)的抑制劑[10]，相關(guān)藥物研究尚無(wú)突破性進(jìn)展。硫酸肝素蛋白多糖（Heparan sulfate proteoglycan，HSPG）由一個(gè)核心蛋白和與之共價(jià)的多個(gè)線性硫酸肝素（Heparan sulfate，HS）側(cè)鏈組成，HS是細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜的主要成分，與其他成分緊密連接[11]。HPA作為人體內(nèi)唯一能夠降解HSPG的特異性內(nèi)源糖苷內(nèi)切酶，通過(guò)識(shí)別HSPG的HS側(cè)鏈并將其降解，進(jìn)而破壞基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，參與血管的生成[12]。相比既往研究較多的MMP，HPA的作用靶點(diǎn)較單一，對(duì)于靶向藥物的研究更具優(yōu)勢(shì)。目前HPA的研究多集中于腫瘤[13]領(lǐng)域，惡性黑素瘤[14]、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌[15]等皮膚腫瘤疾病亦有相關(guān)報(bào)道。Lerner等[16]通過(guò)免疫組化的方法在銀屑病患者皮損及小鼠銀屑病樣模型皮損中檢測(cè)HPA表達(dá)，首次揭示HPA參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制。目前關(guān)于HPA與銀屑病的研究較少，本研究通過(guò)檢測(cè)尋常型銀屑病患者血清HPA水平，進(jìn)一步探討HPA在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HPA與VEGF一樣，在尋常型銀屑病患者血清中表達(dá)升高，顯著高于正常人；同時(shí)血清HPA和VEGF水平的增高程度與銀屑病的分期密切相關(guān)，進(jìn)行期患者血清水平顯著高于靜止期患者。相關(guān)性分析顯示尋常型銀屑病患者血清HPA和VEGF水平與嚴(yán)重程度PASI評(píng)分呈正相關(guān)，提示HPA和VEGF可能參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展，檢測(cè)血清HPA和VEGF水平對(duì)判斷疾病嚴(yán)重程度有一定參考價(jià)值。HPA在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的具體作用有待進(jìn)一步深入研究，或?qū)︺y屑病的診治產(chǎn)生一定影響。