錢盈盈 楊 秀 謝祥成 錢紅萍 章 煒

馬兜鈴酸腎?。╝ristolochic acid nephropathy，AAN）是攝入含有馬兜鈴酸類成分中草藥（如關(guān)木通、廣防己、青木香等）導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)疾病，曾被稱為中草藥腎病[1]。馬兜鈴酸（AA-I）是中草藥腎病和巴爾干地區(qū)特有腎病的主要致病原因[2-3]，迄今為止，其治療策略仍然有限[4]。松弛素（relaxin，RLX）是松弛素/胰島素肽激素家族成員，具有較強(qiáng)的抗纖維化作用[5]，本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察RLX 對(duì)AA-I 刺激的腎小管上皮細(xì)胞（HK-2 細(xì)胞）表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和金屬蛋白酶組織抑制因子1 （tissue inhibitor metallopro-teinase-1，TIMP-1）的影響，探討RLX 在AAN 中抗纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 人腎小管近端上皮細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。重組人松弛素購自美國Peprotech（批號(hào)130-15）；人纖連蛋白（fibronection，F(xiàn)N）ELISA 試劑盒購自武漢博士德（批號(hào)EK0349）、人Ⅳ型膠原（human collagen type Ⅳ，Col-Ⅳ）ELISA 試劑盒購自武漢Cusabio（批號(hào)CSB-E17116h）；PVDF 膜購自美國Millipore 公司（批號(hào)ISEQ00010）；抗體MMP-9/TIMP-1/ACTIN 購自中國Proteintech（批號(hào)分別為27306-1-AP，16644-1-AP，60008-1-Ig）；AA-I 購自美國sigma（批號(hào)313-67-7）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、刺激、分組 HK-2 細(xì)胞于DMEM/F12（Gibco，美國，批號(hào)11320033）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)刺激方法不同隨機(jī)分為：對(duì)照組（無干預(yù)）、AA-I 組（10μg/mL AA-I 刺激48h）、RLX 組（RLX 10ng/mL 干預(yù)48h）、RLX+AA-I 組（RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h）。刺激條件參考文獻(xiàn)[6-7]。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)HK-2 細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況取對(duì)照組、AA-I 組、RLX+AA-I 組HK-2 細(xì)胞上清液，依照試劑盒說明測(cè)定Col-Ⅳ、FN 濃度。每份標(biāo)本均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀在450nm 處測(cè)吸光值，以其均值代表實(shí)驗(yàn)數(shù)值。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 對(duì)照組、AA-I 組、RLX 組、RLX+AA-I 組HK-2 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并離心后，以RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞。經(jīng)煮沸變性、8% w/v SDS-PAGE 凝膠中電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h。膜在TBS-T 中洗滌三次，然后與抗MMP-9、TIMP-1、ACTIN 抗體在4℃下孵育過夜。洗滌3 次，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗常溫下孵育2h。再次以TBST 清洗膜后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)?；叶戎祻?qiáng)度由TINA 圖像軟件（Raytest，德國）測(cè)定。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較 與對(duì)照組比較，AA-I 組FN、Col-Ⅳ水平顯著升高（P＜0.05），RLX+AA-I 組FN、Col-Ⅳ水平明顯低于AA-I 組（P＜0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較（ng/mL，）

表1 各組細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅳ水平比較（ng/mL，）

注：對(duì)照組無任何刺激；AA-I 組予10μg/mL AA-I 刺激48h；RLX+AA-I 組：RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h；FN為纖連蛋白；Col-Ⅳ為Ⅳ型膠原蛋白；AA-I 為馬兜鈴酸；RLX 為松弛素；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AA-I 組比較，bP＜0.05

2.2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，AA-I 組MMP-9 表達(dá)降低，TIMP-1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與AA-I 組比較，RLX+AA-I 組MMP-9 蛋白表達(dá)顯著升高，TIMP-1 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。見圖1、表2。

3 討論

圖1 蛋白質(zhì)印跡分析HK-2 細(xì)胞MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)

表2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)比較（）

注：對(duì)照組無任何刺激；AA-I 組予10μg/mL AA-I 刺激48h；RLX+AA-I 組予RLX 10ng/mL 干預(yù)48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h；MMP-9 為細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9；TIMP-1 為金屬蛋白酶組織抑制因子1；AA-I 為馬兜鈴酸；RLX 為松弛素；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與AA-I 組比較，bP＜0.05

AAN 的主要病理特征是廣泛的小管間質(zhì)纖維化，伴有近端小管萎縮和喪失，偶有少量散在或小灶狀淋巴及單核細(xì)胞浸潤，腎小球無明顯病變或呈缺血性基底膜皺縮及硬化[8]。HK-2 細(xì)胞有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體選擇性攝取AA-I，因此，近端管狀上皮細(xì)胞是AA-I 的易損傷部位[9]。AA-I 反復(fù)作用于腎小管上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)釋放轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor beta，TGF-β）等促纖維因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[10]。此外，AA-I 可誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，轉(zhuǎn)分化后的HK-2 細(xì)胞直接分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，細(xì)胞外基質(zhì)的增加在AA-I 的進(jìn)程中起到非常重要的作用[11]。本研究顯示，AA-I 可顯著增加HK-2 細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)FN 和Col-Ⅳ水平（P＜0.05）。

細(xì)胞外基質(zhì)的過度蓄積是腎間質(zhì)纖維化的主要病理基礎(chǔ)，MMP-9 及TIMP-1 在細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑過程中發(fā)揮了重要作用[12]。細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅依賴肽鏈內(nèi)切酶系，幾乎能降解全部細(xì)胞外基質(zhì)成分[12]。TIMP-1 能特異性地抑制MMPs 的活性，通過不可逆結(jié)合抑制MMP-9 活性，從而抑制其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，兩者的平衡共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。MMP-9 酶活性受到抑制可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而導(dǎo)致腎纖維化[12]。本研究顯示，HK-2 細(xì)胞經(jīng)AA-I 處理后伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)水平的升高，細(xì)胞表達(dá)MMP-9 蛋白減少（P＜0.05），表達(dá)TIMP-1 蛋白增多（P＜0.05），提示MMP-9/TIMP-1 蛋白的失衡可能參與HK-2 細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。

RLX 與胰島素結(jié)構(gòu)相似，通過與RLX 家族肽受體（RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4）受體結(jié)合，可以發(fā)揮多種生物效應(yīng)；RLX 因其在妊娠期間發(fā)揮多種生理效應(yīng)包括子宮收縮、誘導(dǎo)宮頸生長和變軟、結(jié)締組織重構(gòu)等為分娩做準(zhǔn)備而被廣泛認(rèn)識(shí)[14]。近年來，隨著對(duì)RLX 的廣泛深入研究，其在非生殖領(lǐng)域中的作用引起研究者們的極大興趣。RLX 的主要代謝作用在于其可以通過抑制膠原合成、激活MMPs、抑制TIMPs 導(dǎo)致結(jié)締組織重塑，并被證明是有效的抗纖維化藥物[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，RLX 可以誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞MMP-9 表達(dá)升高，抑制TIMP-1 的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)AA-I 誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)異常積累（P＜0.05），認(rèn)為RLX 可能通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 的平衡狀態(tài)改善AA-I 所致腎臟纖維化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示，RLX 可上調(diào)MMP-9 蛋白表達(dá)和下調(diào)TIMP-1 蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而抑制腎小管間質(zhì)纖維化，可能對(duì)AAN起到保護(hù)作用。