湯怡 周強(qiáng) 韓睿 陸威 陶小華 程浩

銀屑病是一種常見(jiàn)的以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其中以尋常型銀屑病最為多見(jiàn)。雖然尋常型銀屑病很少危及生命，但其反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的病程以及嚴(yán)重脫屑的皮損危害患者的身心健康，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前認(rèn)為，銀屑病是Th1細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)的自身免疫性疾病，與遺傳、環(huán)境、病毒感染等相關(guān)[3-4]。近年來(lái)，臨床越來(lái)越關(guān)注用天然免疫來(lái)解釋環(huán)境觸發(fā)和自身免疫T細(xì)胞級(jí)聯(lián)相互作用在銀屑病發(fā)病中的作用[5-7]。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid den－dritic cell，pDC）是最近發(fā)現(xiàn)的具有特征性的樹(shù)突狀細(xì)胞的一個(gè)亞類(lèi)。在機(jī)體內(nèi)，pDC能夠產(chǎn)生大量的α干擾素（IFN-α）和白細(xì)胞介素 12（IL-12），同時(shí) IFN-α 誘導(dǎo)所有T細(xì)胞亞類(lèi)上調(diào)IL-12受體，進(jìn)一步與IL-12共同激活Th1反應(yīng)，活化下游Toll樣受體（toll like receptor，TLR）信號(hào)通路TLR7、TLR9，白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶 1（interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1），干擾素調(diào)節(jié)因子 7（interferon regulatory factor 7，IRF7）[8-9]。目前，pDC在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)情況和具體分布與疾病相關(guān)性尚不明確?；诖?，本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)尋常型銀屑病皮損組織中pDC的特異性表面標(biāo)志分子CD2AP、CD123和TLR7、TLR9及其信號(hào)通路中相關(guān)蛋白分子IRAK-1、IRF7的表達(dá)情況，探討pDC和TLR7/9信號(hào)通路在尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 皮損組織 選取浙江省人民醫(yī)院皮膚科于2017年1至12月收集的19例尋常型銀屑病患者的皮損組織和皮損旁正常組織為研究材料，患者均符合臨床尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男12例，女7例；年齡26～50（39.84±8.00）歲；病程 0.5～18 年，中位 7（3，11）年；主要皮損部位為膝背側(cè)、四肢伸側(cè)。所有患者均排除病毒性肝炎、自身免疫性疾病、結(jié)核及糖尿病等可能影響機(jī)體免疫力的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 兔抗人CD2AP單抗、鼠抗人CD123單抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗人IRAK-1單抗、兔抗人IRF7單抗、鼠抗人TLR7單抗、兔抗人TLR9單抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。免疫組化用過(guò)氧化氫、抗原修復(fù)液、HRP偶連二抗、DAB顯色液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CD2AP、CD123、IRAK-1、IRF7、TLR7、TLR9 免疫組織化學(xué)染色 分別取19例尋常型銀屑病患者的局部皮損組織和對(duì)應(yīng)的皮損旁正常組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成石蠟切片，并進(jìn)行4 μm的連續(xù)切片。免疫組化流程如下：首先取組織樣于60℃烘箱烘30min使蠟融化，依次放入二甲苯-梯度乙醇-水中脫臘浸水；再加入過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；隨后利用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，經(jīng)過(guò)透膜、封閉后加入稀釋好的一抗（兔抗人CD2AP單抗1：100稀釋、鼠抗人CD123單抗1：100稀釋、兔抗人IRAK-1單抗1：50稀釋、兔抗人IRF7單抗1：200稀釋、鼠抗人TLR7單抗1：50稀釋、兔抗人TLR9單抗1：100稀釋?zhuān)┓跤^(guò)夜。次日取出后洗去一抗，加入HRP二抗室溫孵育。之后利用DAB顯色，蘇木素染核，封片觀察并記錄結(jié)果。

1.3.2 免疫組化染色結(jié)果判定 CD2AP、CD123、TLR7、TLR9、IRF7和IRAK-1染色觀察：光鏡下細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃或黃褐色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性率=含陽(yáng)性細(xì)胞的病例數(shù)/總病例數(shù)×100%。半定量計(jì)分：400倍光鏡下觀察拍照，表達(dá)的強(qiáng)度采用基于染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率的半定量評(píng)分法。強(qiáng)度評(píng)分（A）：未染色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；深棕色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分（B）：陽(yáng)性細(xì)胞率＜33%計(jì)1分；33%～66%計(jì)2分；＞66%計(jì)3分。表達(dá)強(qiáng)度為A×B。每張切片取5個(gè)視野進(jìn)行觀察評(píng)分量化，最終取平均值進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尋常型銀屑病皮損組織CD2AP的表達(dá)及分布情況 CD2AP主要表達(dá)于皮膚組織真皮層的單核細(xì)胞，表皮層內(nèi)也有少量表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。CD2AP+細(xì)胞在皮損組織表皮層中的陽(yáng)性率明顯高于皮損旁正常組織表皮層（P＜0.05），同時(shí)CD2AP的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05）；同樣的，CD2AP+細(xì)胞在皮損組織真皮層中陽(yáng)性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD2AP的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 CD2AP在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

2.2 尋常型銀屑病皮損組織中CD123的表達(dá)及分布情況 CD123同樣主要表達(dá)于真皮層的單核細(xì)胞，表皮層內(nèi)有少量表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。CD123+細(xì)胞在皮損組織表皮層中的陽(yáng)性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD123的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05）；同樣，CD123+細(xì)胞在皮損組織真皮層中的陽(yáng)性率明顯高于皮損旁正常組織（P＜0.05），CD123的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于皮損旁組織，見(jiàn)表2。

圖2 CD123在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

2.3 尋常型銀屑病皮損組織中TLR7的表達(dá)及分布情況 TLR7主要表達(dá)于皮損組織真皮層中，以細(xì)胞質(zhì)為主，見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。TLR7+細(xì)胞在皮損組織表皮層中的陽(yáng)性率（47.4%）與皮損旁正常組織（21.1%）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而在皮損組織真皮層中TLR7+細(xì)胞的陽(yáng)性率（42.1%）高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）。

圖3 TLR7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

表1 CD2AP在尋常型銀屑病皮損組織和皮損旁正常組織中的細(xì)胞陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較

表2 CD123在尋常型銀屑病皮損組織和皮損旁正常組織中的細(xì)胞陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較

2.4 尋常型銀屑病皮損組織中TLR9的表達(dá)及分布情況 TLR9在尋常型銀屑病真皮層和表皮層中均有表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主，見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。TLR9+細(xì)胞在皮損組織表皮層中的陽(yáng)性率（89.5%）明顯高于皮損旁正常組織（10.5%，P＜0.05）；而在皮損組織真皮層中TLR9+細(xì)胞的陽(yáng)性率（100.0%）明顯高于皮損旁正常組織（10.5%，P＜0.05）。

圖4 TLR9在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

2.5 尋常型銀屑病皮損組織IRAK-1的表達(dá)及分布情況 IRAK-1主要表達(dá)于皮損組織真皮層中，表皮層可見(jiàn)少量零星表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主，見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。IRAK-1+細(xì)胞在皮損組織表皮層的陽(yáng)性率（31.6%）高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）；在皮損組織真皮層中IRAK-1+細(xì)胞的陽(yáng)性率（100.0%）明顯高于皮損旁正常組織（26.3%，P＜0.05）。

圖5 IRAK-1在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

2.6 尋常型銀屑病皮損組織IRF7的表達(dá)及分布情況 IRF7在皮損組織真皮層和表皮層均有表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)分布，見(jiàn)圖6（插頁(yè)）。IRF7+細(xì)胞在皮損組織表皮層的陽(yáng)性率（47.4%）明顯高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）；IRF7+細(xì)胞在皮損組織真皮層陽(yáng)性率（73.7%）明顯高于皮損旁正常組織（0.0%，P＜0.05）。

圖6 IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及分布情況（DAB染色，×400）

3 討論

尋常型銀屑病是一種Th1細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)的自身免疫性疾病，會(huì)影響遺傳易感人群的皮膚[10]。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注先天免疫在解釋環(huán)境觸發(fā)因素和導(dǎo)致尋常型銀屑病的自身免疫性T細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)加劇之間的作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，pDC通過(guò)產(chǎn)生IFN-α，驅(qū)動(dòng)尋常型銀屑病皮膚中自身免疫T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增，從而導(dǎo)致尋常型銀屑病的發(fā)展?；诖?，本研究通過(guò)pDC的經(jīng)典標(biāo)志物CD2AP和 CD123來(lái)標(biāo)記尋常型銀屑病組織中pDC的數(shù)量，結(jié)果顯示，尋常型銀屑病皮損組織中pDC數(shù)量明顯增加，且大部分存在于真皮組織中。

此外，本研究進(jìn)一步探究了pDC通過(guò)什么信號(hào)通路發(fā)揮功能。有報(bào)道提示pDC是最有潛力的Ⅰ型IFN（IFN-a/β）分泌細(xì)胞，而IFN-α可以誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生Th1型分化信號(hào)的異常激活及活化TLR信號(hào)通路[13-14]。因此，本研究檢測(cè)了TLR信號(hào)通路TLR7/9、IRAK-1、IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，TLR7/9、IRAK-1、IRF7在尋常型銀屑病皮損組織中均存在異常高表達(dá)的情況。這提示抑制pDC的招募以及TLR信號(hào)通路在尋常型銀屑病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其中的作用機(jī)制需要后續(xù)進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在尋常型銀屑病皮損組織中pDC數(shù)量明顯增加，同時(shí)TLR信號(hào)通路（TLR7/9、IRAK-1、IRF7）也有部分活化。這提示pDC的異常增多與TLR信號(hào)的異?；罨瘜?duì)尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展起一定作用，相關(guān)后續(xù)的機(jī)制研究將為針對(duì)性地治療尋常型銀屑病提供理論依據(jù)和新的方向。