吳葉丹，崔晶剛，安昌善

(1 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2 蘇州市立醫(yī)院)

以鉑類藥物為主的聯(lián)合化療方案是治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的常用手段，但其客觀有效率僅30%左右。近年隨著對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及分子靶向藥物研究的不斷深入，分子靶向治療成為最具希望的NSCLC治療策略。厄洛替尼是目前常用的分子靶向藥物之一，在NSCLC治療初期療效顯著，但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，不可避免地出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥現(xiàn)象。厄洛替尼的耐藥機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Met及其配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)與多種實(shí)體腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1～4]，26%～40%的EGFR基因突變型NSCLC患者伴有HGF高表達(dá)和EGFR-T790M突變，其中5%～33%的患者伴有Met基因擴(kuò)增和EGFR-T790M突變，4%～7%的患者伴有HGF高表達(dá)和Met基因擴(kuò)增[5～7]。人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5分泌的HGF可誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞對(duì)厄洛替尼耐藥，其機(jī)制可能與刺激c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[8]。SU11274是一種靶向c-Met的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移。2016年7～12月，本研究觀察了SU11274對(duì)HGF誘導(dǎo)NSCLC厄洛替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料

人NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9(EGFR突變型，敏感株)，由同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。雌性BALB/c裸鼠49只，SPF級(jí)，4周齡，14～16 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003。所有裸鼠飲用水過(guò)氯化為12～15 ppm，飼料由120 ℃高壓蒸氣滅菌45 min，每日維持10 h光照+14 h黑暗的明暗周期。厄洛替尼原料藥，大連美侖生物技術(shù)有限公司。SU11274，美國(guó)Sigma公司。SynergyTMH1全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。HGF(人源)ELISA試劑盒，美國(guó)R&D Systems公司。1% Tween-80，上海弘順生物科技有限公司。RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、還原型5×SDS上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人c-Met、兔抗人磷酸化c-Met(p-c-Met)、兔抗人Akt、兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)、兔抗人Erk1/2、兔抗人磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)單抗，美國(guó)CST公司；兔抗人Stat3、兔抗人磷酸化Stat3(p-Stat3)單抗，美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，美國(guó)Epitomics公司。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.2 HGF體外對(duì)厄洛替尼抑制PC-9細(xì)胞增殖作用及其機(jī)制

2.2.1 MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液HGF水平觀察 取傳3代以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化3 min，800 r/min離心4 min，收集細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板(孔內(nèi)加入含雙抗和10% FBS的DMEM培養(yǎng)液2 mL)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h。將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，以800 r/min離心4 min，留取上清液，-80 ℃保存待測(cè)。采用SynergyTMH1全功能酶標(biāo)儀、ELISA法檢測(cè)兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液HGF。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，PC-9細(xì)胞培養(yǎng)上清液HGF水平<0.1 pg/mL，MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液HGF水平為(1 262.07±89.78)pg/mL。表明MRC-5細(xì)胞能分泌HGF，而PC-9細(xì)胞不分泌HGF。

2.2.2 HGF對(duì)厄洛替尼抑制PC-9細(xì)胞增殖作用 取傳5代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔種于96孔板，待細(xì)胞貼壁，分別加入0.01～0.1 μmol/L厄洛替尼(共設(shè)10個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度增加0.01 μmol/L，每個(gè)濃度梯度設(shè)4個(gè)復(fù)孔)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL的 MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，再加入DMSO 200 μL，充分振蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀于530 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，0.01～0.1 μmol/L厄洛替尼作用后，PC-9細(xì)胞增殖率從80%降至20%(表明細(xì)胞增殖率隨厄洛替尼濃度增加而降低，即厄洛替尼可抑制PC-9細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性)，根據(jù)細(xì)胞增殖率計(jì)算得出厄洛替尼IC50為(0.05±0.01)μmol/L。將PC-9細(xì)胞接種于含DMEM與50% MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液(DMEM與MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液等體積混合)的培養(yǎng)液中，按上述方法檢測(cè)厄洛替尼IC50時(shí)PC-9細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示，加入50% MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，在厄洛替尼IC50時(shí)PC-9細(xì)胞增殖率為78.24%。表明HGF能抑制厄洛替尼對(duì)PC-9細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2.3 HGF對(duì)PC-9細(xì)胞c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)的影響 采用Western blotting法。取傳3代以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞，隨機(jī)分為HGF組和空白組，分別以5×105個(gè)/孔接種于含或不含50% MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入還原型5×SDS上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30～40 μg，100 V恒壓下行SDS-PAGE 120 min。電泳結(jié)束，以半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別兔抗人c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2及p-c-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2、GAPDH單抗(稀釋比均為1∶400)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比為1∶1 000)，室溫?fù)u床上孵育1 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光、顯影。采用Tanon GIS系列數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描各蛋白電泳條帶，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組c-Met及其下游通道蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，*P<0.05。

2.3 SU11274在裸鼠體內(nèi)對(duì)厄洛替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.3.1 裸鼠皮下移植瘤模型制作及干預(yù) 所有裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，以隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、HGF組、HGF+DMSO組、HGF+SU11274組、厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組，每組7只。對(duì)照組和厄洛替尼組于右肋皮下接種密度為5×106個(gè)/mL PC-9細(xì)胞懸液100 μL，其他組均于右肋皮下接種密度相同的PC-9細(xì)胞與MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清液的混合液100 μL。當(dāng)腫瘤直徑生長(zhǎng)至約4 mm時(shí)，對(duì)照組、HGF組予1% Tween-80 10 mL/(kg·d)灌胃，HGF+DMSO組予10% DMSO 10 mL/(kg·d)灌胃，厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組予厄洛替尼25 mg/(kg·d)灌胃，每周5次，連續(xù)4周。HGF+SU11274組、HGF+厄洛替尼+SU11274組灌胃后腹腔注射SU11274 0.18 mg/(kg·d)，每周5次，連續(xù)4周。

2.3.2 抑瘤率觀察 各組分別于灌胃4、7、11、14、18、21、25天，以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(L)、腫瘤短徑(D)，計(jì)算腫瘤體積(V)。V=0.5×L×D2。各組移植瘤體積見(jiàn)表2。末次灌胃結(jié)束，斷頸處死，完整剝離移植瘤組織，稱取腫瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量)/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量×100%。結(jié)果顯示，對(duì)照組、HGF組、HGF+SU11274組、HGF+DMSO組、厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組移植瘤質(zhì)量分別為(680.31±373.38)、(804.84±492.36)、(712.71±258.15)、(566.07±363.59)、(108.89±83.76)、(361.19±172.08)、(106.04±41.03)mg。HGF組、HGF+SU11274組、HGF+DMSO組抑瘤率均接近于0，厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組抑瘤率分別為83.99%、46.91%、84.41%。與HGF+厄洛替尼組比較，厄洛替尼組與HGF+厄洛替尼+SU11274組抑瘤率明顯升高(P均<0.05)，而厄洛替尼組與HGF+厄洛替尼+SU11274組比較P>0.05。結(jié)果提示，HGF可抑制厄洛替尼的抗腫瘤作用，而SU11274能逆轉(zhuǎn)HGF對(duì)厄洛替尼的抗腫瘤作用，提高厄洛替尼的抗腫瘤效果。

表2 各組移植瘤體積比較

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與HGF組比較，☆P<0.05；與HGF+SU11274組比較，◇P<0.05；與厄洛替尼組比較，▽P<0.05；與HGF+厄洛替尼組比較，#P<0.05。

2.3.3 移植瘤組織c-Met及其下游通道蛋白表達(dá) 取各組移植瘤組織，固定、包埋，制作石蠟切片。將石蠟切片脫蠟、水化后，用3% H2O2室溫孵育30 min，微波爐加熱抗原修復(fù)，5%羊血清室溫封閉30 min。棄羊血清，加入p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2、c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2一抗(稀釋比均為1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比為1∶200)，室溫孵育2 h。DAB顯色，蘇木素復(fù)液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。c-Met、p-Met定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Stat3、Erk1/2定位于細(xì)胞質(zhì)，p-Stat3、p-Erk1/2定位于細(xì)胞核，Akt、p-Akt定位于細(xì)胞質(zhì)，均呈棕色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行對(duì)光密度的半定量分析。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組移植瘤組織c-Met及其下游通道蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組、HGF+SU11274組、厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組比較，*P<0.05；與對(duì)照組、HGF組、HGF+DMSO組、HGF+厄洛替尼組比較,#P<0.05；與對(duì)照組、HGF+SU11274組、厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼+SU11274組比較,△P>0.05。

3 討論

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，與配體結(jié)合激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、遷移及血管生成等[9,10]。第一代可逆性EGFR-TKI及第二代不可逆性EGFR-TKI均能與EGFR共價(jià)結(jié)合，明顯延長(zhǎng)EGFR突變基因陽(yáng)性NSCLC患者無(wú)進(jìn)展生存期[11～14]。TKI應(yīng)用初期，其單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可阻止NSCLC患者EGFR、c-Met基因突變，但隨著應(yīng)用時(shí)間延長(zhǎng)，易出現(xiàn)獲得性耐藥，繼而限制了其臨床應(yīng)用。研究證實(shí)，EGFR-TKI的耐藥機(jī)制與HGF誘導(dǎo)c-Met及下游信號(hào)通路持續(xù)激活有關(guān)[15，16]。因此，抑制HGF誘導(dǎo)的c-Met及其下游通路激活有可能逆轉(zhuǎn)NSCLC對(duì)EGFR-TKI的耐藥。

c-Met蛋白是由50 kDa的細(xì)胞外α亞基和140 kDa的跨膜β亞基組成的異二聚體，是一種具有酪氨酸激酶活性的HGF/分散因子受體[17]。HGF與c-Met的Sema區(qū)結(jié)合可激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/Akt、Ras和Rac/Rho和Ras/MAPK等，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和血管生成等[18]，而在腫瘤細(xì)胞中則可促進(jìn)腫瘤血管生成，繼而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[19]。因此，HGF/Met抑制劑成為治療NSCLC的關(guān)鍵療法之一。

SU11274是一種特異性靶向c-Met的小分子抑制劑，可特異性抑制c-Met受體信號(hào)傳導(dǎo)[20]。研究證實(shí)， SU11274在Tpr-Met轉(zhuǎn)化細(xì)胞及小細(xì)胞肺癌模型中均有效[21]。SU11274是依賴HGF信號(hào)傳導(dǎo)的有效抑制劑，能與Met受體的ATP-poket緊密結(jié)合，繼而抑制c-Met受體激活且其特異性較高(IC50為10 nmol/L)[22]。SU11274在體外可通過(guò)干擾HGF/c-Met信號(hào)通路抑制NSCLC、結(jié)腸癌、胰腺癌等細(xì)胞增殖與侵襲[23，24]。SU11274作為一種Met抑制劑，可逆轉(zhuǎn)由高濃度HGF所致的不同EGFR基因突變型NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI耐藥[25]。第一代TKI可明顯抑制EGFR基因突變型NSCLC生長(zhǎng)，但隨著HGF濃度升高，激活c-Met及其下游信號(hào)通道，可導(dǎo)致腫瘤耐藥。聯(lián)合應(yīng)用SU11274可明顯抑制黑色素瘤生長(zhǎng)[26]。此外，SU11274對(duì)c-Met激酶活性的抑制導(dǎo)致時(shí)間和劑量依賴性的細(xì)胞生長(zhǎng)減少，下調(diào)cyclin D1并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯在G1期，并引起細(xì)胞凋亡[27]。

本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGF組在厄洛替尼IC50時(shí)PC-9細(xì)胞增殖率明顯低于空白組，磷酸化c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)明顯高于空白組，表明HGF可能通過(guò)影響c-Met及其下游蛋白磷酸化而干擾厄洛替尼對(duì)PC-9細(xì)胞增殖的抑制作用。本研究移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，厄洛替尼能夠抑制厄洛替尼組、HGF+厄洛替尼組及HGF+厄洛替尼+SU11274組移植瘤生長(zhǎng)，對(duì)HGF+厄洛替尼+SU11274組抑瘤效果明顯高于HGF+厄洛替尼組，但與厄洛替尼組相仿，說(shuō)明SU11274可逆轉(zhuǎn)HGF介導(dǎo)PC-9細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的耐藥，從而恢復(fù)厄洛替尼的抗腫瘤作用。進(jìn)一步觀察移植瘤組織c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與HGF組、HGF+DMSO組和HGF+厄洛替尼組比較，厄洛替尼組、HGF+SU11274組和HGF+厄洛替尼+SU11274組移植瘤組織p-Met、p-Stat3、p-Akt、p-Erk1/2表達(dá)均降低，表明厄洛替尼在HGF誘導(dǎo)下不能抑制PC-9細(xì)胞c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2活化，但在無(wú)HGF刺激下或HGF刺激下聯(lián)合應(yīng)用c-Met抑制劑SU11274則能明顯抑制PC-9細(xì)胞內(nèi)c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2磷酸化。

綜上所述，HGF可誘導(dǎo)NSCLC對(duì)厄洛替尼的耐藥，c-Met及其下游信號(hào)通路持續(xù)激活是NSCLC對(duì)厄洛替尼耐藥的重要機(jī)制；c-Met抑制劑SU11274和厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的NSCLC對(duì)厄洛替尼的耐藥，其機(jī)制可能與抑制c-Met及其下游信號(hào)通路激活有關(guān)。