石宇紅，任亞飛，蔣亞男，許佳，李寶貞，朱芳曉，莫漢有

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西桂林541002)

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病終末期改變，其發(fā)病機制尚不完全清楚。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[1,2]；核因子κB(NF-κB)可通過調(diào)節(jié)TGF-β1分泌影響肺纖維化進程[3]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22 nt的單鏈非編碼小分子RNA，可通過抑制靶基因翻譯參與多種重要的生物學過程。miR-146a是miRNA家族成員之一，在NF-κB信號通路中具有負性調(diào)控作用，可通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6、IL-1受體相關激酶1、母親DDP同源物蛋白(Smad)等表達而調(diào)控NF-κB信號通路[4]。2016年2月～2017年11月，我們觀察了miR-146a對肺纖維化小鼠肺成纖維細胞增殖的影響，并探討其在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料

雄性C57BL/6小鼠30只，SPF級，體質(zhì)量20～26 g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，瑞士Roche公司；博來霉素，日本化藥株式會社；miR-146a引物、miR-146a mimics(miR-146a激活劑)、miR-146a陰性對照物、β-actin引物，上海捷瑞生物工程有限公司；鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。Masson染色試劑盒，南京建成生物工程研究所；Western blotting試劑盒，上海拜力生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.2 肺纖維化組織miR-146a表達檢測

2.2.1 肺纖維化模型制作 將30只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術組和模型組，每組15只。兩組均給予1%氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件下鈍性分離并暴露氣管，模型組一次性向氣管內(nèi)滴入博來霉素3.5 mg/kg，假手術組在相同條件下滴入等體積生理鹽水，滴完后將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)5 min。造模后第28天，兩組均給予1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈放血后處死，完整分離肺臟，去除結(jié)締組織，將左肺組織迅速放入-80 ℃液氮中凍存，以備提取肺組織總RNA；將右肺組織迅速置于40 g/L甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，分別行HE染色和Masson染色。HE染色結(jié)果顯示，假手術組肺泡結(jié)構(gòu)正常，偶見炎性細胞浸潤；模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔內(nèi)可見大量纖維細胞，纖維組織片狀或條索狀增生，肺泡間隔消失或斷裂。Masson染色結(jié)果顯示，模型組可見大量綠色的膠原纖維堆積，膠原纖維增生。上述結(jié)果提示，肺纖維化模型制備成功。

2.2.2 肺纖維化組織miR-146a表達檢測 采用RT-PCR法。取出液氮中凍存的左肺組織，采用TRIzol法提取肺組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA純度及濃度合格。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物由美國Invitrogene公司設計合成，miR-146a上游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′，下游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCC-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系共20 μL，包括上下游引物各0.4 μmol/L，Taqman熒光探針0.2 μmol/L，2×Taqman universal PCR Mastermix 10 μL，cDNA 1 μL(相當于0.1 μg RNA)，補水至20 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、62 ℃ 1 min(45個循環(huán))。以U6作為內(nèi)參，采用標準曲線法計算miR-146a相對表達量。結(jié)果顯示，模型組及假手術組肺組織miR-146a相對表達量分別為(2.06±0.52)×10-4、(7.25±0.36)×10-4，兩組比較P<0.01。

2.3 miR-146a過表達對肺纖維化細胞增殖及NF-κB信號通路相關因子表達的影響

2.3.1 肺成纖維細胞培養(yǎng)及鑒定 取造模第28天模型組肺組織，無菌條件下用眼科剪剪為1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，采用組織塊培養(yǎng)法進行成纖維細胞原代培養(yǎng)。HE染色觀察細胞形態(tài)學特征，可見梭形成纖維細胞排列緊密，細胞核為規(guī)則卵圓形，核仁大而明顯，胞質(zhì)透明，并彼此連接成網(wǎng)狀。采用免疫細胞化學染色方法檢測波形蛋白、肌動蛋白表達，結(jié)果顯示肌動蛋白陰性、波形蛋白陽性，符合成纖維細胞免疫表型特點。

2.3.2 過表達miR-146a的肺成纖維細胞模型建立 將成纖維細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為1×105個/孔。隨機將細胞分為miR-146a過表達組、對照組、空白組，每組5個復孔。當細胞融合至50%左右時，miR-146a過表達組加入5 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和6 μL miR-146a mimics，對照組加入5 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和6 μL miR-146a陰性對照物，空白組加入等體積緩沖液。三組均于培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染24 h，完全培養(yǎng)基中止轉(zhuǎn)染，再培養(yǎng)36 h，收集細胞，采用RT-PCR法檢測miR-146a表達，具體步驟參照2.2.2。結(jié)果顯示，miR-146a 過表達組miR-146a相對表達量為(7.53±0.68)×10-4，對照組為(1.32±0.12)×10-4，空白組為(1.17±0.25)×10-4；miR-146a過表達組高于其他兩組(P均<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。提示過表達miR-146a的成纖維細胞模型建立成功。

2.3.3 過表達miR-146a的成纖維細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。取三組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)36 h的對數(shù)生長期成纖維細胞，以2×107個/孔密度接種于96孔板，每孔加入15 μL CCK-8溶液，飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)2 h。采用酶標儀測定460 nm波長處的吸光度(A460)值，計算細胞增殖率。結(jié)果顯示，miR-146a 過表達組細胞增殖率為(13.47±1.83)%，對照組為(33.87±1.32)%，空白組為(32.57±1.54)%， miR-146a過表達組低于其他兩組(P均<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。

2.3.4 過表達miR-146a的成纖維細胞NF-κB信號通路相關因子表達檢測 采用Western blotting法。取三組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)36 h的對數(shù)生長期成纖維細胞，按RIPA試劑盒說明書提取蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。取部分蛋白行10% SDS-PAGE，采用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入TGF-β1、NF-κB p65一抗(工作液濃度分別為1∶100、1∶750)，4 ℃孵育過夜，ECL顯色。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，PhotoshopCS5.0軟件檢測各組條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算TGF-β1蛋白相對表達量；以β-actin、LaminB1作為內(nèi)參，分別計算NF-κB p65及核因子κB 抑制蛋白α(IκBα)蛋白相對表達量。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，與對照組和空白組比較，miR-146a過表達組TGF-β1、IκBα蛋白相對表達量均降低(P<0.05)，NF-κB p65蛋白相對表達量增高(P<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。見表1。

表1 三組TGF-β1、NF-κB p65及IκBα蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

3 討論

肺成纖維細胞活化是肺纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié)和關鍵步驟[5]。當肺成纖維細胞受到致纖維化因子刺激時，其表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，后者可表達α-SMA，合成大量膠原，細胞外基質(zhì)合成增多、降解減少導致異常沉積，誘導肺泡上皮細胞發(fā)生凋亡，促進肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[6～8]。TGF-β1是肺纖維化進程中的關鍵性細胞因子，是纖維化發(fā)生與發(fā)展的啟動因子，能啟動成纖維細胞的增殖和分裂過程[9]；TGF-β1還能促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞[10]，并分泌大量細胞外基質(zhì)及膠原，誘導肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展[11]。研究證實，TGF-β1的合成受NF-κB調(diào)控[12]。NF-κB屬于真核細胞核轉(zhuǎn)錄因子家族成員，p65是其主要的功能亞單位[13]。NF-κB在非活化狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，與多種基因啟動子或增強子部位的κB位點特異性結(jié)合后被活化，其活化后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，參與TGF-β1合成[14]。IκBα是NF-κB的負性調(diào)節(jié)劑，增加IκBα的合成或抑制其降解可抑制NF-κB活性[15]。通過采用腺病毒攜帶IκB基因轉(zhuǎn)染呼吸道上皮細胞，可促進細胞表達IκB，抑制NF-κB活化，調(diào)節(jié)TGF-β1分泌[16]。

miRNA是一類小分子編碼RNA，通過使靶基因降解或阻止其翻譯轉(zhuǎn)錄負向調(diào)控或沉默靶基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與炎癥調(diào)節(jié)并在固有免疫中發(fā)揮作用[17,18]，其與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、干燥綜合征、銀屑病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展相關。在纖維化方面的研究中也發(fā)現(xiàn)，通過注射外源性miR-146a后可通過抑制促纖維化因子釋放和炎癥通路激活抑制腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展[19]。有研究還發(fā)現(xiàn)，miR-146a還可通過作用于肝星狀細胞的TGF/Smad和LPS/NF-κB/Bambi信號通路阻斷肝纖維化進程[20]。

本研究結(jié)果顯示，模型組miR-146a相對表達量明顯低于假手術組，提示miR-146a下調(diào)可促進肺纖維化的發(fā)生。為驗證miR-146a下調(diào)在肺纖維化發(fā)生中的作用，我們制作了過表達miR-146a的成纖維細胞模型并觀察了其細胞增殖及NF-κB信號通路相關因子表達情況，結(jié)果顯示，miR-146a過表達組細胞增殖率明顯低于對照組及空白組，TGF-β1及IκBα蛋白表達明顯低于對照組及空白組，NF-κB p65蛋白表達明顯高于對照組及空白組。進一步證實miR-146a對肺成纖維細胞增殖有抑制作用。其抑制成纖維細胞增殖的機制可能為：miR-146a 3′端啟動子區(qū)域存在多個核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點[21]，TNF-α、IL-1等炎癥相關因子作用于細胞后激活IκBα，發(fā)生磷酸化并脫離NF-κB后，使NF-κB的核定位信號區(qū)暴露，促進NF-κB磷酸化，使其向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，參與TGF-β1合成，同時誘導了miR-146a表達，上調(diào)的miR-146a則可負反饋調(diào)節(jié)抑制NF-κB信號通路，負性調(diào)控NF-κB活化，抑制其下游因子TGF-β1釋放，從而調(diào)控細胞增殖程度。過表達miR-146a可導致NF-κB信號通路受抑制，核內(nèi)轉(zhuǎn)移減少，TGF-β1合成減少，從而抑制細胞增殖。

綜上所述，肺纖維化小鼠肺組織miR-146a表達下調(diào)，其可通過阻止細胞內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)位而抑制成纖維細胞增殖和分化，從而延緩肺纖維化的發(fā)生及進展。