李楊，黃鄧高，鄭琳麟，曹卉，高元慧，范忠誠

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院，?？?70208)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，目前在我國其患病率已超過慢性腎小球腎炎，已成為慢性腎臟病的首位病因[1]。糖尿病腎病的確切發(fā)病機制尚不完全清楚。有研究認(rèn)為，糖尿病腎病是一種多基因遺傳異質(zhì)性疾病，遺傳因素可通過影響腎臟對環(huán)境因素的反應(yīng)性來增加糖尿病腎病的易感性。Klotho基因是一種與衰老有關(guān)的基因，主要在腎臟中表達(dá)[2～4]，具有抗腎臟纖維化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抑制氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因與糖尿病和糖尿病腎病有關(guān)，該基因突變會導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄功能改變，可能會導(dǎo)致代謝紊亂加重[6]。Klotho基因含有多個單核苷酸多態(tài)性位點，其G-395A位點(rs1207568)位于啟動子區(qū)域，而啟動子作為順式作用元件的一部分，可參與調(diào)控基因表達(dá)。因此，G-395A位點突變雖不能改變Klotho蛋白的氨基酸序列，但可能是影響Klotho基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)之一。本研究探討Klotho基因G-395A位點多態(tài)性與糖尿病腎病的關(guān)系?，F(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 臨床資料

選取2016年1月～2017年10月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院收治的單純2型糖尿病患者147例(單純糖尿病組)，男76例、女71例，年齡(50.7±5.5)歲，BMI (25.1±1.2)kg/m2；糖尿病腎病患者98例(糖尿病腎病組)，男57例、女41例，年齡(52.0±9.1)歲，BMI (26.6±3.8)kg/m2。糖尿病診斷符合1999年WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病腎病診斷符合《中國2型糖尿病防治指南》(2010版)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除合并惡性腫瘤、急慢性感染性疾病者。選擇同期在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院體檢的健康志愿者100例(健康組)，男57例、女43例，年齡(52.1±6.2)歲，BMI (24.4±3.1)kg/m2。研究對象均為長期生活在海南地區(qū)的漢族人，相互之間無血緣關(guān)系。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。三組血壓、血糖、血脂等相關(guān)指標(biāo)比較見表1。

表1 三組血壓和血生化相關(guān)指標(biāo)比較

組別 n TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C (mmol/L) BUN (mmol/L) Scr(μmol/L)健康組 100 1.74±1.42 3.27±1.17 1.51±0.32 5.40±1.28 61.01±13.07單純糖尿病組147 1.92±1.30 3.24±1.13 1.55±0.28 5.87±1.35 70.08±20.76糖尿病腎病組98 2.40±1.14?3.65±1.41 1.44±0.40 8.01±1.92?#118.90±26.10?#

注：與健康組比較，*P<0.05；與單純糖尿病組比較，#P<0.05。

2 方法與結(jié)果

2.2 Klotho基因G-395A位點多態(tài)性檢測 三組均采集空腹靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管中，室溫靜置30 min，分離血細(xì)胞，按柱式小量血液DNA抽提試劑盒說明抽提基因組DNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)中TaqMan熒光探針法檢測G-395A(rs1207568)位點多態(tài)性。將選定的G-395A(rs1207568)多態(tài)性位點在Applied Biosystems公司網(wǎng)站上查找相應(yīng)的TaqMan-MGB探針，將探針標(biāo)號及多態(tài)性位點一起送至Applied Biosystems公司合成引物和探針。按PCR反應(yīng)試劑盒說明配制反應(yīng)體系，于ABI Prism7300型熒光定量PCR擴增儀按相應(yīng)的反應(yīng)條件進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系共15 μL：20×引物及熒光探針混合溶液0.5 μL，2×TaqMan通用PCR擴增預(yù)混試劑7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，A模板1.5 μL，滅菌蒸餾水5.2 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并將測序結(jié)果與Klotho基因序列進(jìn)行Blast比對。采用基因計數(shù)法計算各組基因型及等位基因分布。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，三組Klotho基因G-395A位點基因型分布均符合遺傳平衡定律，說明研究對象均具有樣本代表性。由于GG基因型相對較少，與GA合并分析。結(jié)果顯示，健康組GA基因型+GG基因型49例、AA基因型51例，單純糖尿病組分別為70、77例，糖尿病腎病組分別為30、68例，健康組與單純糖尿病組AA基因型分布明顯低于糖尿病腎病組，GA基因型+GG基因型分布明顯高于糖尿病腎病組(P均<0.05)，健康組與單純糖尿病組AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比較P均>0.05；健康組A、G等位基因頻數(shù)分別為132、68，單純糖尿病組分別為199、95，糖尿病腎病組分別為157、39，健康組與單純糖尿病組A等位基因頻數(shù)明顯低于糖尿病腎病組，G等位基因頻數(shù)明顯高于糖尿病腎病組(P均<0.05)，健康組與單純糖尿病組A、G等位基因頻數(shù)比較P均>0.05。見表2。

表2 各組Klotho基因G-395A位點基因型和等位基因分布情況

2.3 糖尿病腎病發(fā)病的危險因素分析 以糖尿病腎病為應(yīng)變量，以表1中有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)(SBP、FPG、HbA1c、TC、TG、BUN、Scr)及G-395A位點基因型(AA、GA+GG)為自變量，進(jìn)行多因素非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，SBP、HbA1c、G-395A位點AA基因型分布增加是糖尿病腎病發(fā)病的危險因素。見表3。

表3 糖尿病腎病發(fā)病的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

Maeda等[7]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，染色體13q區(qū)異常與糖尿病腎病的易感性有關(guān)。Klotho基因定位于13q12區(qū)域，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，G-395A位點位于其啟動子區(qū)域，本身并不編碼任何蛋白質(zhì)，而是參與調(diào)控基因表達(dá)[8]。Klotho基因是一種與衰老有關(guān)的基因，具有抗腎臟纖維化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抑制氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)功能。Klotho蛋白主要表達(dá)于腎臟、腦組織脈絡(luò)膜、甲狀旁腺等組織，尤其是腎皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因表達(dá)變化與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其高表達(dá)具有腎臟保護(hù)作用[10，11]；早期糖尿病腎病患者腎組織Klotho基因表達(dá)降低[12]。體外和體內(nèi)研究證實，過表達(dá)Klotho基因或及時補充外源性Klotho蛋白可保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能，延緩糖尿病腎病進(jìn)展。目前認(rèn)為，Klotho基因可通過抑制細(xì)胞凋亡、抵抗機體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制高糖對腎臟的損傷[13]；Klotho基因可調(diào)控RAAS系統(tǒng)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，通過調(diào)控多種細(xì)胞因子表達(dá)，抑制腎臟纖維化；Klotho基因還可調(diào)節(jié)鈣磷代謝，阻止血管平滑肌細(xì)胞鈣化，調(diào)控離子轉(zhuǎn)運，繼而保護(hù)腎臟[14]。Klotho蛋白缺乏時可通過增強TGF-β1、mTOR信號通路，促進(jìn)早期糖尿病腎病的發(fā)生[15]；而過表達(dá)Klotho基因可通過下調(diào)早期生長反應(yīng)因子1而抑制TGF-β1/Smad3信號通路，從而抑制腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)形成，減輕腎臟纖維化[16]。

Klotho基因G-395A位點是重要的遺傳篩選標(biāo)記和潛在的功能性多態(tài)性位點，該位點多態(tài)性可影響啟動子的轉(zhuǎn)錄過程。故本研究觀察了海南地區(qū)漢族人群Klotho基因G-395A位點多態(tài)性與糖尿病腎病的關(guān)系。有研究顯示，糖尿病患者或小鼠胰島組織Klotho基因表達(dá)降低[17～19]。Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠胰腺β細(xì)胞Klotho基因過表達(dá)可改善高血糖所致的β細(xì)胞損傷，降低高血糖并增加糖耐量；增加循環(huán)中Klotho蛋白對糖尿病患者也有類似效果。Forsberg等[18]研究顯示，db/db小鼠肝組織Klotho基因過表達(dá)可導(dǎo)致血糖水平下降，胰島β細(xì)胞功能得以改善。上述結(jié)果提示，無論過表達(dá)Klotho基因還是補充外源性Klotho蛋白對糖尿病均有益。Kawano等[20]應(yīng)用電泳遷移率變動分析顯示，由G等位基因形成的DNA蛋白復(fù)合物的量明顯高于由A等位基因形成的DNA蛋白復(fù)合物的量，提示G突變?yōu)锳可能通過減少蛋白和啟動子的結(jié)合而影響Klotho基因的功能。本研究結(jié)果顯示，Klotho基因G-395A位點出現(xiàn)了AA、GA、GG三種基因型，健康組與單純糖尿病組AA基因型分布明顯低于糖尿病腎病組，GA基因型+GG基因型分布明顯高于糖尿病腎病組，而健康組與單純糖尿病組AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；健康組與單純糖尿病組A等位基因頻數(shù)明顯低于糖尿病腎病組，G等位基因頻數(shù)明顯高于糖尿病腎病組，而健康組與單純糖尿病組A、G等位基因頻數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。多因素Logistic回歸分析顯示，Klotho基因G-395A位點AA基因型分布增加是發(fā)展為糖尿病腎病的危險因素。提示A等位基因可能通過抑制Klotho基因表達(dá)，繼而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，最終出現(xiàn)糖尿病腎病。但此結(jié)論還需大規(guī)模、多中心的臨床研究驗證。

綜上所述，Klotho基因G-395A位點多態(tài)性與糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)，該位點AA基因型分布增加可能是糖尿病腎病發(fā)病的獨立危險因素。