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肝細胞癌組織核因子E2相關(guān)因子3表達變化及意義

2018-11-02 01:26王振偉陶佳郝帥晏亭楊玉菡劉虹邑任勇剛
山東醫(yī)藥 2018年36期
關(guān)鍵詞:肝細胞分化肝硬化

王振偉,陶佳,郝帥,晏亭,楊玉菡,劉虹邑,任勇剛

(1 川北醫(yī)學院,四川南充637000;2 川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

肝細胞癌是起源于肝細胞的惡性腫瘤,其發(fā)生、發(fā)展是一個漫長的過程,涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳學及腫瘤免疫學等[1,2]。與肝細胞癌發(fā)生最相關(guān)的遺傳學因素包括宿主細胞p53、Ras、Rb等基因突變,但與肝細胞癌發(fā)生相關(guān)的特異性基因尚未明確[3,4]。核因子E2相關(guān)因子3(NFE2L3)屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族,又稱Nrf3,定位于染色體7p15.2,編碼694個氨基酸,其生物學功能尚未闡明[5~7]。目前鮮見關(guān)于NFE2L3與肝細胞癌有關(guān)的報道。本研究探討肝細胞癌組織NFE2L3表達變化及意義。現(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月~2017年9月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的肝細胞癌患者44例,男34例、女10例,年齡43~70(55.24±8.03)歲;組織分化程度:低分化23例,中分化12例,高分化9例;合并肝硬化27例,乙肝36例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期31例,Ⅲ、Ⅳ期13例;Child-Pugh肝功能分級:A級25例,B、C級19例。肝細胞癌診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》中肝癌診斷標準,TNM分期符合美國癌癥聯(lián)合會和國際抗癌聯(lián)盟標準。納入標準:經(jīng)組織病理學檢查及血清標志物檢測明確診斷為肝細胞癌;除肝細胞癌外無其他惡性腫瘤;手術(shù)切除腫瘤,術(shù)中留取癌旁正常組織;術(shù)前未進行放療、化療及免疫治療;臨床病理資料完整。本研究經(jīng)川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,患者或其家屬均知情同意。

1.2 肝組織NFE2L3表達檢測 采用免疫組化兩步法。取肝癌組織及癌旁正常組織,石蠟包塊,3~5 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,加入3%過氧化氫50 μL,室溫孵育10 min;浸于檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)組織抗原30 min;滴加5% BSA封閉液,室溫孵育10 min,棄去多余液體;滴加NFE2L3一抗(工作液濃度1∶25,美國ABGENT公司),37 ℃孵育3~4 h;滴加聚合HRP標記抗兔IgG,37 ℃孵育30 min;DAB顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。以PBS代替NFE2L3一抗作為陰性對照,陽性對照為已知NFE2L3蛋白陽性表達的組織切片。NFE2L3陽性表達主要定位于細胞質(zhì),在細胞核也有表達,呈散在分布的淡黃色或棕黃色顆粒。根據(jù)染色強度及陽性細胞所占比例綜合評分判定結(jié)果[8]。陽性細胞染色強度為不著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別記0、1、2、3分;陽性細胞所占比例<10%記0分,10%~<25%記1分, 25%~<50%記2分, 50%~<75%記3分,≥75%記4分。兩項評分之和>4分為NFE2L3陽性表達。分析肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)分析 下載TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中關(guān)于肝細胞癌的RNASeq Version2數(shù)據(jù)(Level 3,normalizeddata)。肝細胞癌數(shù)據(jù)集共包括371例份肝細胞癌組織和51例份癌旁正常組織。測序平臺為Illumina hiseq2000,數(shù)據(jù)下載時間為2017年8月。利用R(Version3.4.0)軟件包limma提供的經(jīng)驗貝葉斯方法對基因表達值進行線性建模[9],然后進行肝癌組織與癌旁正常組織NFE2L3表達的差異分析。檢驗后得到NFE2L3平均表達值(AveExpr)、肝癌組織與癌旁正常組織差異表達倍數(shù)(log2FC),相應(yīng)統(tǒng)計學差異分析的P,使用Benjamini & Hochberg方法進行多重檢驗校正,得到校正后P(adj.P)。差異表達閾值均為adj.P<0.05且|log2FC|>1(即2倍變化)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁正常組織NFE2L3表達比較 肝癌組織NFE2L3陽性表達率為70.45%(31/44),癌旁正常組織為15.91%(7/44),二者比較P<0.05。

2.2 肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤組織分化程度、患者是否合并乙肝有關(guān)(P均<0.01),與患者性別、年齡、是否合并肝硬化、TNM分期、肝功能分級無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫肝細胞癌數(shù)據(jù)集中肝癌組織和癌旁正常組織NFE2L3表達比較 肝癌組織NFE2L3表達顯著高于癌旁正常組織,log2FC=0.750 121 651,AveExpr=2.336 727 847,P<0.01,adj.P<0.01。

3 討論

肝細胞癌多呈低分化,侵襲和轉(zhuǎn)移能力強,復(fù)發(fā)率和病死率均較高[10]。核因子E2(NFE2)家族為高度保守的調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子家族,主要參與維持細胞穩(wěn)態(tài)和組織發(fā)育[11]。NFE2家族主要包括NFE2L1、NFE2L2、NFE2L3、NF-E2 p45及其轉(zhuǎn)錄抑制因子Bach1、Bach2[12]。目前,關(guān)于抗氧化基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究多集中于NFE2L2及NFE2L1。當出現(xiàn)病毒感染、外源性藥物、炎癥等刺激時,機體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)被打破,誘導(dǎo)激活NFE2成員,調(diào)節(jié)NAD(P)H醌脫氫酶1基因表達[13,14]。通常情況下,NFE2蛋白與Maf蛋白結(jié)合組成二聚體,通過抗氧化應(yīng)激元件結(jié)合于靶基因啟動子,調(diào)節(jié)下游基因表達。NFE2家族成員在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育中扮演重要角色,尤其是NFE2L1[15]。Xu等[16]研究發(fā)現(xiàn),成年小鼠肝細胞NFE2L1基因被敲除后易形成脂肪肝并有可能惡變?yōu)楦伟?。進一步研究證實,相對于高分化肝癌組織,低分化肝癌組織NFE2L1表達顯著降低,并扮演抑癌基因角色;NFE2L1可能通過促進細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,參與肝癌的發(fā)生和進展[17]。此外,NFE2家族在非酒精性脂肪肝病的發(fā)生及進展中也發(fā)揮重要作用,其作用機制主要包括影響胰島素耐受、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和刺激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等[18~21]。

NFE2L3廣泛表達于人體組織器官,其作為一種高度保守的調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子,通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件和親電子體反應(yīng)元件,調(diào)控下游基因表達,維持細胞穩(wěn)態(tài)。與同源的NFE2L1、NFE2L2相比,目前對NFE2L3功能的研究相對較少。Sankaranarayanan等[22]報道,NFE2L3通過抑制細胞黏附,促進紫外線誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細胞凋亡。Chowdhury等[23]研究則證實,NFE2L3通過作用于蛋白酶體等調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖。最近的研究結(jié)果顯示,NFE2L3的結(jié)構(gòu)修飾和區(qū)域改變對調(diào)控細胞分化、炎癥反應(yīng)和細胞癌變具有重要意義[24],但其具體的分子機制仍不清楚。

本研究結(jié)果顯示,肝癌組織NFE2L3陽性表達率顯著高于癌旁正常組織,提示NFE2L3可能作為促癌基因直接或間接作用促進肝癌的發(fā)生。但有研究報道,NFE2L3對人大腸癌LoVo細胞增殖具有一定抑制作用,其可能作為抑癌基因參與大腸癌的發(fā)生[25,26],與本研究結(jié)果矛盾,其原因可能為NFE2L3在肝細胞癌和結(jié)直腸癌組織中的基礎(chǔ)表達有一定差異,故其生物學功能不同。本研究肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤組織分化程度有關(guān),低分化肝癌組織NFE2L3陽性表達顯著高于中高分化組織,提示NFE2L3可能是一個與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在生物標記分子。本研究肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤TNM分期、肝功能分級無關(guān),可能與樣本量偏少有關(guān)。NFE2L3陽性表達與肝癌患者是否合并乙肝顯著相關(guān),但與是否合并肝硬化無明顯相關(guān)。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細胞癌發(fā)生的病因之一。HBV能夠在宿主細胞內(nèi)持續(xù)存在,并協(xié)同遺傳學及表觀遺傳學改變,共同調(diào)控參與肝細胞癌發(fā)生的信號通路[27]。HBV的HBX基因被認為不能直接與DNA結(jié)合,而是通過與轉(zhuǎn)錄因子、信號分子等因子相互作用直接或間接發(fā)揮調(diào)控功能[28]。已有研究證實,HBX基因能夠反式激活宿主細胞基因,促進血管內(nèi)皮生長因子、Myc原癌基因等生長因子及原癌基因表達[29]。在應(yīng)激刺激下,HBV可通過調(diào)節(jié)NFE2L3表達,介導(dǎo)下游促炎、抗炎信號通路,調(diào)控細胞增殖、凋亡等相關(guān)基因表達,促進乙肝向肝癌惡性轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn),NFE2L3陽性表達與患者是否合并肝硬化并無顯著相關(guān),這可能是由于肝硬化病因廣泛,既可能是HBV感染引起的,也可能是長時間飲酒或代謝性異常引起的。肝硬化與肝細胞癌的確切關(guān)系還有賴于后期擴大樣本、完善分組并結(jié)合細胞、動物模型進一步明確。

為進一步驗證臨床病例研究結(jié)果,明確NFE2L3在肝癌組織和癌旁正常組織中的差異表達,本研究利用生物信息學方法分析了TCGA數(shù)據(jù)庫收集的肝細胞癌數(shù)據(jù)集。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,NFE2L3基因在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織,但其差異表達倍數(shù)log2FC較小,AveExpr為2.336 727 847,P<0.01。以上分析結(jié)果與本研究檢測結(jié)果一致,進一步在大范圍樣本中確認轉(zhuǎn)錄因子NFE2L3在肝癌組織中高表達,并與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),可能是肝細胞癌發(fā)生的一種促癌因子。

綜上所述,NFE2L3可能作為促癌因子參與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。

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