葉松慶，李永全

(天津市泰達醫(yī)院，天津300457)

隨著社會發(fā)展和人口老齡化進程加快，各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)損傷性疾病、神經(jīng)退行性疾病等成為困擾人類健康的重要問題。由于神經(jīng)元具有不可再生性，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療難度大，患者多有嚴重后遺癥。神經(jīng)干細胞是一類具有自我更新、多向分化潛能的干細胞，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1]。神經(jīng)干細胞作為一種種子細胞，在神經(jīng)干細胞移植中能替代損失的神經(jīng)細胞，支持損傷神經(jīng)物理結(jié)構(gòu)，減少炎癥反應(yīng)，以及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等[2，3]，目前已用于脊髓損傷、腦損傷、帕金森病等神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病的治療。但移植細胞本身對損失神經(jīng)組織細胞的替代作用非常有限。神經(jīng)干細胞本身可通過旁分泌機制調(diào)控微環(huán)境，對干細胞自身特性的維持以及定向分化具有重要作用[4]；在病理狀態(tài)下，神經(jīng)干細胞可通過旁分泌進行細胞間應(yīng)答[5]。因此認為，神經(jīng)干細胞移植的治療效果可能主要歸因于神經(jīng)干細胞的旁觀者效應(yīng)。本文結(jié)合文獻就神經(jīng)干細胞的旁分泌類型、作用機制以及在不同疾病模型中的治療效果作一綜述。

1 神經(jīng)干細胞概述

1.1 神經(jīng)干細胞來源 在胚胎發(fā)育時期，神經(jīng)干細胞存在于大部分腦區(qū)，而成體神經(jīng)干細胞僅存在于腦內(nèi)固定區(qū)域。1992年首次從大鼠腦組織紋狀體中分離出神經(jīng)干細胞[6]，之后腦室周、齒狀回、海馬等部位神經(jīng)干細胞陸續(xù)被鑒定和分離出來[7]。目前認為，成年哺乳動物神經(jīng)干細胞所在區(qū)域為腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層[8]。之后，人們又陸續(xù)從脊髓、嗅球等組織分離出神經(jīng)干細胞[9，10]，并形成了標準化分離、培養(yǎng)體系，大大加速了神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1.2 神經(jīng)干細胞的特性 神經(jīng)干細胞的生物學(xué)特性具有以下幾點：①來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)組織細胞；②通過對稱分裂產(chǎn)生的兩個子細胞均為干細胞，而通過不對稱分裂產(chǎn)生的兩個子細胞，一個為干細胞，另一個為祖細胞，從而具有自我維持和自我更新能力；③具有區(qū)域異質(zhì)性，如嗅球中間神經(jīng)元和胼胝體的少突膠質(zhì)細胞來源于室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細胞；齒狀回神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞來源于齒狀回顆粒細胞下層的神經(jīng)干細胞。

1.3 神經(jīng)干細胞的旁分泌功能 細胞之間的信號傳遞是調(diào)節(jié)細胞功能的重要方式，包括內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌，其中旁分泌是調(diào)節(jié)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和應(yīng)答外界不良刺激的重要機制。就神經(jīng)干細胞而言，其旁分泌方式可歸納為兩類：一類包括生長因子、細胞因子、趨化因子、生物活性脂類以及細胞外基質(zhì)等旁分泌因子，一類是細胞外囊泡，其中以外泌體最具代表性。見圖1。

圖1 神經(jīng)干細胞旁分泌示意圖

2 神經(jīng)干細胞旁分泌對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用

神經(jīng)干細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制為移植細胞本身對損失神經(jīng)組織細胞的替代作用和移植細胞旁分泌所產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)[11]。神經(jīng)干細胞移植后能夠在組織內(nèi)存活，并在一定條件下分化為神經(jīng)細胞，與原有組織形成生理性細胞間聯(lián)系，繼而重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路[12]。然而移植細胞面臨的往往是一個病理性微環(huán)境，結(jié)合移植本身帶來的二次損傷，易導(dǎo)致移植細胞壞死和凋亡。神經(jīng)干細胞在自然分化狀態(tài)下很難滿足特定的細胞種類，不能分化為理想的細胞種類。因此，移植細胞本身對損失神經(jīng)組織細胞的替代作用非常有限。目前認為，神經(jīng)干細胞移植的治療效果可能主要歸因于神經(jīng)干細胞的旁觀者效應(yīng)。神經(jīng)干細胞的旁觀者效應(yīng)是指神經(jīng)干細胞旁分泌產(chǎn)物作用于移植部位對微環(huán)境所產(chǎn)生的優(yōu)化，包括減輕微環(huán)境中負性調(diào)控因子和增加內(nèi)源性修復(fù)能力。研究證實，脊髓損傷后神經(jīng)干細胞移植能促進軸索再生，增加髓鞘化，并促進血管再生以及減少膠質(zhì)瘢痕形成[13]。在卒中模型中發(fā)現(xiàn)，移植的神經(jīng)干細胞即使未分化，仍能促進神經(jīng)功能恢復(fù)[14]。在肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥模型中，移植的神經(jīng)干細胞能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進運動神經(jīng)元存活和再生[15]。提示這些過程同樣依賴于神經(jīng)干細胞的旁觀者效應(yīng)而非替代作用。

2.1 旁分泌因子對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用

2.1.1 保護神經(jīng)元 ①減少神經(jīng)元凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基在體外能夠增加M2型巨噬細胞比例，并減少M1型巨噬細胞活化和炎性細胞因子釋放，脊髓損傷小鼠給予神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基，能促進脊髓功能恢復(fù)[16]。持續(xù)給予脊髓損傷大鼠神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基還能增加皮質(zhì)脊髓束和中間神經(jīng)元之間的橋接，減少神經(jīng)元凋亡，促進大鼠運動功能恢復(fù)[17]。另外，在亨廷頓病大鼠模型中，神經(jīng)干細胞分泌的干細胞因子能夠保護多巴胺能神經(jīng)元，減少神經(jīng)元凋亡[18]。②分泌神經(jīng)元保護因子。Lee等[19]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基較普通培養(yǎng)基能夠更好地發(fā)揮神經(jīng)保護作用，其保護作用歸因于神經(jīng)干細胞旁分泌的S-medium、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性營養(yǎng)因子(GDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子。有研究證實，神經(jīng)干細胞移植后，以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)為代表的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子在損傷部位表達持續(xù)升高[20]；神經(jīng)干細胞C17.2能夠持續(xù)分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括BDNF、NGF、GDNF，并且高表達NT3的神經(jīng)干細胞還能顯著增加NGF、BDNF表達[21]；人源性神經(jīng)干細胞能夠分泌BDNF，而且移植神經(jīng)干細胞分泌的BDNF能夠促進紋狀體神經(jīng)元存活[18]。

2.1.2 神經(jīng)重塑 研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞移植能夠增加中風(fēng)患者腦組織VEGF、血小板反應(yīng)蛋白1/2以及富含半胱氨酸的酸性蛋白表達，而這些因子是促進樹突生長、軸索可塑性和軸索運輸?shù)年P(guān)鍵[14]。Chen等[22]通過對比神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基中32種細胞因子和趨化因子發(fā)現(xiàn)，以白血病抑制因子(LIF)為代表的29種分泌因子均表達升高；神經(jīng)干細胞分泌的LIF不僅能上調(diào)靶細胞LIF受體，還通過JAK-STAT信號通路促進靶細胞增殖和存活[22]。有學(xué)者通過質(zhì)譜分析方法從神經(jīng)干細胞形成的神經(jīng)球條件培養(yǎng)基中鑒定出了磷酸酶蛋白聚糖、載脂蛋白E以及血清胱抑素C，其中磷酸酶蛋白聚糖是一種重要的硫酸軟骨素蛋白聚糖，能夠促進神經(jīng)球形成，穩(wěn)定神經(jīng)球三維結(jié)構(gòu)并促進神經(jīng)干細胞本身存活，其作用主要通過EGFR、JAK/STAT3及PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)[23]。

2.1.3 抗氧化應(yīng)激 神經(jīng)干細胞的旁分泌受細胞本身狀態(tài)和微環(huán)境影響，一些不良刺激能夠引起細胞激活并促進細胞生長。目前已知的一些刺激因素，如細胞激活、低氧或輻射、氧化應(yīng)激等，均可導(dǎo)致細胞旁分泌增加[24]。因此，神經(jīng)干細胞所處的特殊缺氧微環(huán)境可能決定其旁分泌產(chǎn)物具有增加細胞缺氧以及不良環(huán)境的耐受能力。研究證實，神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基具有天然抗N-甲基-D-天冬氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)興奮性毒性作用[25]；使用3-硝基丙酸預(yù)處理神經(jīng)干細胞能增加其抗氧化應(yīng)激能力，這一效應(yīng)是通過增加神經(jīng)干細胞BDNF、CNTF以及VEGF分泌實現(xiàn)的，最終使神經(jīng)元上調(diào)超氧化物歧化酶2實現(xiàn)抗凋亡和抗氧化應(yīng)激作用[26]。

2.1.4 免疫調(diào)理 研究證實，神經(jīng)干細胞移植能夠在脊髓損傷中發(fā)揮免疫調(diào)理作用，不僅能減少脊髓損傷后M1型巨噬細胞產(chǎn)生，還能增加M2型巨噬細胞產(chǎn)生，而M2型巨噬細胞能夠吞噬細胞崩解產(chǎn)物并分泌抗炎因子，起到抑制炎癥反應(yīng)的作用[27]。此外，神經(jīng)干細胞大量分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子亦能減輕炎癥反應(yīng)[28]。在多發(fā)性硬化模型中，移植的神經(jīng)干細胞不僅能減少T淋巴細胞增殖，還能通過分泌FasL、Trail、Apo3L等因子促進浸潤的T淋巴細胞凋亡[29]。在中風(fēng)模型中，移植的神經(jīng)干細胞也能通過旁分泌作用阻止外周巨噬細胞激活和動員[30]。

2.2 旁分泌細胞外囊泡對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用 近年來，旁分泌細胞外囊泡獲得了廣泛關(guān)注。根據(jù)細胞外囊泡形成機制可分為微囊泡、外泌體以及凋亡小體[31]。在疾病治療中具有潛力的主要是微囊泡和外泌體。微囊泡是由細胞質(zhì)膜直接外翻形成的，粒徑較大(100～1 000 nm)，甚至可以包裹轉(zhuǎn)運多核糖體[32]。外泌體是由多泡體與質(zhì)膜結(jié)合釋放的腔內(nèi)囊泡，粒徑較小(50～120 nm)，可包裹大量蛋白質(zhì)、mRNA以及miRNA，其在細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，已成為當前研究的熱點。

2.2.1 外泌體來源蛋白 Kang等[33]通過串聯(lián)質(zhì)譜方法對人類神經(jīng)干細胞來源外泌體進行蛋白測定，鑒定出了103種蛋白，包括HSP70、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、多肌炎/硬皮病自身抗原2等，其中HSP70被認為是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護劑，包括顱腦損傷、化學(xué)毒性神經(jīng)損傷以及阿爾茨海默癥，其機制可能是通過抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮保護作用的。在免疫調(diào)節(jié)方面，神經(jīng)干細胞的細胞外囊泡內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸分選與炎癥細胞因子誘導(dǎo)后干擾素γ信號通路激活有關(guān)；使用干擾素γ和腫瘤壞死因子α模擬神經(jīng)炎癥微環(huán)境，可使神經(jīng)干細胞的細胞外囊泡分選包裝神經(jīng)保護蛋白，進而影響微環(huán)境中的T淋巴細胞、巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞以及樹突細胞等免疫細胞，從而改善微環(huán)境，實現(xiàn)神經(jīng)保護作用[34]。

2.2.2 外泌體來源miRNA Stevanato等[35]采用第二代測序技術(shù)對神經(jīng)干細胞外泌體內(nèi)的miRNA進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了113種miRNA；該研究還發(fā)現(xiàn)，在miRNA包裹過程中存在明顯的分選機制。目前已知多種miRNA對神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病具有修復(fù)和治療作用，如miR-132、miR-21等，神經(jīng)干細胞在炎癥等應(yīng)激刺激下可通過獨特的分選機制包裹保護性的miRNA，進而將這些miRNA直接轉(zhuǎn)運至靶細胞，在靶細胞內(nèi)表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控細胞行為，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，神經(jīng)干細胞能夠通過旁分泌分泌多種因子及細胞外囊泡，對神經(jīng)系統(tǒng)起到神經(jīng)再生、再髓鞘化、免疫調(diào)理及神經(jīng)重塑等作用。目前對神經(jīng)干細胞的旁分泌機制尚不完全清楚。今后研究的重點是進一步優(yōu)化神經(jīng)干細胞旁分泌的神經(jīng)保護作用，包括使用缺氧或輻射等理化手段刺激產(chǎn)生數(shù)量更多的旁分泌產(chǎn)物以及使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生更多具有治療潛力的因子或mRNA、miRNA等。神經(jīng)干細胞的旁觀者效應(yīng)是神經(jīng)損傷修復(fù)的重要機制，其旁分泌產(chǎn)物對神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療潛力巨大，有可能成為替代神經(jīng)干細胞移植的治療手段。