劉兆玉，葛金麗，周震滄，王玉蘭，李強(qiáng)，李行

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563002)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤的最常見類型，多見于中老年人，以40～50歲居多。DLBCL是一類具有高度異質(zhì)性的疾病，其在臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)學(xué)、免疫表型及遺傳學(xué)特征等方面都具有明顯異質(zhì)性。目前DLBCL的發(fā)病原因和機(jī)制尚不完全清楚，臨床上缺乏特異性診斷標(biāo)志物，易誤診[1～3]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類重要的細(xì)胞凋亡抑制因子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4，5]。Livin是IAP家族中的新成員，是從人類基因組cDNA庫中由IAP同源序列克隆獲得，可抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域活性[6]。Caspase家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)。Caspase-3屬于Caspase家族成員之一，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡方式參與機(jī)體生理、病理過程，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究觀察了DLBCL患者病變淋巴組織Livin和Caspase-3表達(dá)變化，并探討其在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中的作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床資料

選擇2012年1月～2017年3月遵義市第一人民醫(yī)院收治的DLBCL患者69例(DLBCL組)。所有患者經(jīng)組織病理檢查明確診斷，入院前未行任何抗腫瘤治療，排除合并其他影響本研究檢測結(jié)果的疾病者以及臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男38例、女31例，年齡25～78(59.32±13.57)歲；首發(fā)部位：淋巴結(jié)內(nèi)35例，淋巴結(jié)外34例；病理類型：生發(fā)中心B細(xì)胞(GCB)型17例，非GCB型52例；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例。選擇同期遵義市第一人民醫(yī)院收治的反應(yīng)性增生性淋巴結(jié)炎(RHL)患者30例(RHL組)，男17例、女13例，年齡31～74(60.13±9.22)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)遵義市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.2 病變淋巴組織Livin、Caspase-3表達(dá)檢測 采用免疫組化Elivision法。取兩組病變淋巴組織標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，置于檸檬酸緩沖液中95 ℃熱抗原修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫。PBS沖洗3 min×3次，滴加兔抗人Livin多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3 min×3次，滴加Elivision試劑盒試劑A(聚合物增強(qiáng)劑)，室溫孵育20 min。滴加Elivision試劑盒試劑B(酶標(biāo)抗兔IgG聚合物)，室溫孵育30 min。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。采用雙盲法由兩位病理科高年資醫(yī)師獨(dú)立閱片，結(jié)果不一致時，由上級醫(yī)師判定。結(jié)果判定采用半定量評分法。隨機(jī)選取4個400倍視野，觀察每視野染色強(qiáng)度并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比例。Livin、Caspase-3陽性染色均定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淺黃色為1分，黃棕色為2分，褐色為3分；陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。以染色強(qiáng)度計(jì)分和陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分綜合判定Livin、Caspase-3陽性表達(dá)，二者計(jì)分乘積>3分為陽性表達(dá)。結(jié)果顯示，DLBCL組與RHL組病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)率分別為57.97%(40/69)、0，Caspase-3陽性表達(dá)率分別為24.64%(17/69)、86.67%(26/30)。DLBCL組病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達(dá)率均高于RHL組(χ2分別為29.182、32.745，P均<0.01)。

2.3 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 GCB型DLBCL患者病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)率低于非GCB型者，Caspase-3陽性表達(dá)率高于非GCB型者(P均<0.01)；Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期者病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)率低于Ⅲ、Ⅳ期者， Caspase-3陽性表達(dá)率高于Ⅲ、Ⅳ期者(P均<0.05)；Livin、Caspase-3陽性表達(dá)與患者年齡、性別、首發(fā)部位均無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.4 DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)與Caspase-3陽性表達(dá)的關(guān)系 DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)與Caspase-3陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.308，P<0.01)。

表1 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

2.5 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 患者出院后通過電話、門診等方式隨訪，隨訪截至2017年12月，隨訪時間9～62(36.13±14.14)個月，中位隨訪時間33個月。DLBCL病變淋巴組織Livin陰性表達(dá)者與陽性表達(dá)者生存率分別為86.21%(25/29)、42.50%(17/40)，生存時間分別為(52.14±2.65)、(42.50±2.74)個月；DLBCL病變淋巴組織Livin陰性表達(dá)者生存率和生存時間均高于Livin陽性表達(dá)者(P均<0.01)。DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陰性表達(dá)者與陽性表達(dá)者生存率分別為51.92%(27/52)、88.24%(15/17)，生存時間分別為(44.71±2.48)、(50.18±3.09)個月；DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陽性表達(dá)者生存率和生存時間均高于Caspase-3陰性表達(dá)者(P均<0.01)。

3 討論

Livin定位于染色體20q13.3，具有兩種異構(gòu)體，分別為Livin-α、Livin-β，其cDNA長度分別為897、843 bp，二者分布雖有一定差異，但總體上變化不大[6，7]。正常成人機(jī)體中Livin只表達(dá)于胚胎及胎盤組織，未見于其他組織。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織中可見Livin陽性表達(dá)。如在中晚期直腸癌組織中Livin異常高表達(dá)，且其陽性表達(dá)者預(yù)后較差[8]；在乳腺癌組織中Livin異常高表達(dá)，且通過p38/GSK3β信號通路促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，Livin高表達(dá)者預(yù)后較Livin低表達(dá)者差[9]。在關(guān)于人肺腺癌組織及A549細(xì)胞的聯(lián)合研究中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織Livin異常高表達(dá)，經(jīng)相關(guān)微小RNA沉默Livin表達(dá)的肺腺癌A549細(xì)胞增殖減少、凋亡增加[10]。說明Livin可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在DLBCL病變淋巴組織中Livin陽性表達(dá)率明顯升高，且其陽性表達(dá)與Ann Arbor分期密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)Livin參與了DLBCL的發(fā)生、發(fā)展過程。GCB型DLBCL患者病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)率顯著低于非GCB型者，提示Livin與DLBCL的起源有關(guān)。

目前認(rèn)為，Livin抑制細(xì)胞凋亡主要通過兩個途徑，即激活TAK1/JNK1信號通路[11]、抑制Caspase途徑[12]。Caspase家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)。Caspase-3屬于Caspase家族成員之一，是細(xì)胞凋亡過程中的下游效應(yīng)蛋白，其編碼基因定位于染色體4q32-35.1，主要表達(dá)于人體細(xì)胞胞質(zhì)部位，但細(xì)胞核中亦可表達(dá)[13]。機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3以酶原形式存在，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)源性或外源性凋亡途徑，Caspase-3即會被激活，因而可將Caspase-3視為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志因子[14]。Caspase-3通過調(diào)控細(xì)胞凋亡不僅參與機(jī)體生理、病理過程，還與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織Caspase-3表達(dá)明顯低于正常組織，且隨著腫瘤的惡性進(jìn)展，Caspase-3表達(dá)進(jìn)一步降低。Yusuf等[16]報(bào)道，在結(jié)直腸癌組織中Caspase-3表達(dá)明顯降低，且其低表達(dá)者預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陽性表達(dá)率明顯降低，且其表達(dá)與患者Ann Arbor分期有關(guān)。說明DLBCL的發(fā)生、發(fā)展可能與Caspase-3表達(dá)受抑制有關(guān)。

Gu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織Livin表達(dá)與Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用替莫唑胺的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞Livin表達(dá)下降，同時Caspase-3表達(dá)上升，二者表達(dá)同樣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)與Caspase-3陽性表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示Livin、Caspase-3在DLBCL中的效應(yīng)可能與前述組織中類似，即二者具有拮抗作用。本研究隨訪結(jié)果顯示，DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達(dá)者生存率低于Livin陰性表達(dá)者，生存時間短于Livin陰性表達(dá)者；DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陰性表達(dá)者生存率低于Caspase-3陽性表達(dá)者、生存時間短于Caspase-3陽性表達(dá)者。提示Livin陽性表達(dá)及Caspase-3陰性表達(dá)的DLBCL患者預(yù)后不良。

綜上，DLBCL病變淋巴組織Livin表達(dá)上調(diào)、Caspase-3表達(dá)下調(diào)，二者表達(dá)變化可能參與DLBCL的發(fā)生、發(fā)展，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。