黃夢穎，陳建輝，邱玉鋒，楊勁松，陳愛平

沙門菌是一種常見的食源性腸道致病菌。其宿主范圍廣泛，人一經(jīng)感染會(huì)引發(fā)一系列的病癥，包括輕微的腸胃炎，嚴(yán)重的甚至引起全身性感染。即使臨床治愈后，約3%的患者膽囊中仍攜帶沙門菌，并且可持續(xù)由糞便排泄達(dá)1年及以上，成為重要的傳染源[1]。沙門菌中存在許多毒力因子，如毒力基因及其產(chǎn)物[2]，能刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列反應(yīng)，使其能侵入宿主細(xì)胞，并在其中生長繁殖。目前，已有研究對(duì)毒力基因invA及spvB在福建省沙門菌分離株中的分布情況進(jìn)行了報(bào)道[3]。本文對(duì)福建省分離的腹瀉患者與健康人群沙門菌菌株進(jìn)行毒力基因sitC及iroN的擴(kuò)增檢測，以便了解福建省沙門菌sitC及iroN毒力基因分布情況。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本實(shí)驗(yàn)涉及的沙門菌來自福建省其它感染性腹瀉監(jiān)測點(diǎn)及福建省屬食品從業(yè)人員健康體檢。其中，腹瀉患者以鼠傷寒、腸炎和斯坦利血清型最為常見。健康人群以德爾卑和腸炎血清型最為常見。所以本實(shí)驗(yàn)選取鼠傷寒、腸炎、德爾卑及斯坦利4種血清型，共166株沙門菌；其中腹瀉患者121株、健康人群45株。

1.2試劑與儀器 本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PCR反應(yīng)試劑、DL2000 Marker購自Takara公司；瓊脂糖、溴化乙錠(10 mg/mL)等購自上海生工。 Veriti Dx擴(kuò)增儀(AB applied biosystems公司)；Basic電泳儀；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌株的分離鑒定 參照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS271-2007)、《從業(yè)人員預(yù)防性健康檢查沙門菌、志賀菌檢驗(yàn)方法》(WS/T454-2014)提供的方法進(jìn)行分離鑒定。

1.3.2引物設(shè)計(jì) 引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增片段長度[4]見表1。

1.3.3細(xì)菌DNA提取 采用煮沸法提取。刮取適量分離純化后的菌落于純水中制成300 μL菌懸液。100 ℃煮沸10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清作為PCR模板。

1.3.4PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 采用20 μL反應(yīng)體系：Ex Taq DNA聚合酶0.5 U，dNTP 200 μmol/L，上游引物0.4 μmol/L，下游引物0.4 μmol/

表1 PCR引物
Tab.1 PCR primers

基因引物序列(5'-3')目的片段長度(bp)sitCF-CAGTATATGCT-CAACGCGATGTGGGTCTCC768R-CGGGGCGAAAATAAAG-GCTGTGATGAACiroNF-ACTGGCACGGCTCGCT-GTCGCTCTAT1205R-CGCTTTACCGCCGTTCTGC-CACTGC

L，DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，總延伸72 ℃ 5 min。

1.3.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 將取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.3.6統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1毒力基因sitC及iroN的檢出情況 166株沙門菌分離株中檢出含有毒力基因sitC及iroN的菌株數(shù)分別為86株和66株，總檢出率分別為51.81%(86/166)和39.76%(66/166)。

從血清型來看，鼠傷寒、腸炎、德爾卑和斯坦利四種血清型沙門菌中也均檢出了一定比例的毒力基因sitC及iroN。sitC毒力基因在鼠傷寒、腸炎、德爾卑和斯坦利4種血清型的檢出率分別為：36.62%、63.64%、65.22%、58.82%；iroN的檢出率分別為：26.76%、52.73%、60.87%、23.53%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，這2個(gè)毒力基因在4種血清型中的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2sitC=11.634，P=0.009；χ2iroN=15.020，P=0.002)。具體見表2、表3。

表2 不同組別各血清型沙門菌毒力基因sitC的檢出情況
Tab.2 Detection of Salmonella virulence gene sitC in different groups

鼠傷寒腸 炎德爾卑斯坦利合 計(jì)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù))檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 腹瀉患者23(61)37.7025(42)59.524(5)80.009(13)69.2361 (121)50.41健康人群3(10)30.0010(13)76.9211(18)61.111(4)25.0025(45)55.56 合 計(jì)26(71)36.6235(55)63.6415(23)65.2210(17)58.8286(166)51.81

表3 不同組別各血清型沙門菌毒力基因iroN的檢出情況
Tab.3 Detection of Salmonella virulence gene iroN in different groups

鼠 傷 寒腸 炎德 爾 卑斯 坦 利合 計(jì)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù))檢出率(%)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%) 陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 檢出率(%)腹瀉患者16 (61)26.2320 (42)47.623 (5)60.004 (13)30.7743 (121)35.54 健康人群3 (10)30.009 (13)69.2311 (18)61.110 (4)0.0023 (45)51.11 合 計(jì)19 (71)26.7629 (55)52.7314 (23)60.874 (17)23.5366 (166)39.76

2.2毒力基因sitC及iroN的攜帶模式情況 從腹瀉患者及健康人群的糞便標(biāo)本中分離到的沙門菌中，毒力基因sitC及iroN攜帶模式的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher’s確切概率P=0.067)。在兩個(gè)組別中，sitC+iroN+及sitC-iroN-都是最常見的攜帶模式。具體見表4。

表4 不同組中沙門菌毒力基因sitC及iroN的攜帶模式情況
Tab.4 Carrying patterns of Salmonella virulence genes sitC and iroN in different groups

sitC+iroN+sitC+iroN-sitC-iroN+sitC-iroN-陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 構(gòu)成比(%)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 構(gòu)成比(%)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 構(gòu)成比(%)陽性數(shù)(標(biāo)本數(shù)) 構(gòu)成比(%)腹瀉患者41(121)33.88 20(121)16.532(121)1.6558(121)47.93 健康人群23(45)51.112(45)4.440(45)0.0020(45)44.44

3 討 論

繁殖決定因素是細(xì)菌致病力的重要決定因子之一，其多數(shù)與細(xì)菌的營養(yǎng)相關(guān)。為了生存繁殖，沙門菌必須擁有從宿主細(xì)胞內(nèi)獲得營養(yǎng)元素的能力。其中一種重要的營養(yǎng)元素就是鐵離子[5]。當(dāng)沙門菌入侵時(shí)，宿主會(huì)編碼高親和力的鐵結(jié)合蛋白作為非特異性防御機(jī)制阻止沙門菌入侵。所以，沙門菌也形成了一套精細(xì)、復(fù)雜且高親和的鐵離子攝取系統(tǒng)以保證在鐵缺乏的環(huán)境中也能快速繁殖[6]。目前研究已發(fā)現(xiàn)了許多鐵離子攝取系統(tǒng)。其中sitABCD系統(tǒng)位于沙門菌63’處的毒力島I上[5-6]。sitC是sitABCD家族的一員，其編碼一種通透酶[6]。在富含鐵離子的環(huán)境中，sitC操縱子的轉(zhuǎn)錄受到Fur的抑制[6]。iroN也位于沙門菌染色體上，其編碼的鐵載體蛋白位于外膜上，是沙門菌特有的抗原，有利于沙門菌在土壤里生長繁殖[7]。iroN可能與食源性沙門菌病的暴發(fā)有關(guān)[8]。本文就選取了這2個(gè)與鐵攝入相關(guān)的毒力基因進(jìn)行研究。

熊海平等對(duì)南通市沙門菌毒力基因分布的研究中發(fā)現(xiàn)sitC和iroN這兩個(gè)基因在所有分離株中都存在[9]。而其他的一些研究中，這兩個(gè)基因的檢出率也都高達(dá)90%以上[10-12]。而本研究的結(jié)果顯示，福建省沙門菌分離株中毒力基因sitC和iroN的檢出率只有51.81%和39.76%，比上述報(bào)道的要低。這可能是由于不同地區(qū)、不同來源的沙門菌分離株毒力基因分布存在一些差異。

在對(duì)鳥類[4]和火雞[13]中分離的沙門菌菌株的研究中發(fā)現(xiàn)毒力基因sitC和iroN在患病及健康兩個(gè)組別中的分布不存在差異。這一發(fā)現(xiàn)與本文研究的結(jié)果是一致的。在本文的研究中，這兩個(gè)基因在福建省腹瀉患者和健康人群中的分布也不存在顯著差異。但是，在對(duì)豬[10]中分離的沙門菌菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，從患病的豬中分離到的沙門菌菌株中iroN的攜帶率明顯高于健康的。而sitC并無差異。另有發(fā)現(xiàn)表明iroN與從引起沙門菌病爆發(fā)的食物中分離到的沙門菌菌株正相關(guān)[8]。這就預(yù)示著這兩個(gè)基因在發(fā)病機(jī)制中所起的作用可能是不一樣的。sitC可能更傾向于幫助沙門菌在宿主體內(nèi)生長繁殖。而iroN可能不僅有助于沙門菌的生長繁殖，而且還與沙門菌的致病性相關(guān)。本研究從健康人群中分離出的沙門菌菌株數(shù)較少，研究結(jié)果可能會(huì)有偏差，今后我們將加大標(biāo)本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

沙門菌的部分毒力基因在不同血清型中的存在情況會(huì)有所不同。但是，現(xiàn)有的報(bào)道中毒力基因sitC和iroN的存在情況并不存在血清型差異[9-12]。有趣的是本研究中，沙門菌的這2個(gè)毒力基因sitC和iroN在鼠傷寒、腸炎、德爾卑和斯坦利4種血清型中的分布存在顯著差異。其中，德爾卑沙門菌中檢出率最高，分別為65.22%和60.87%；其次是腸炎沙門菌，分別為63.64%和52.73%；而鼠傷寒沙門菌中這兩個(gè)基因的檢出率都不高，分別為36.62%和26.76%。2003年以前，鼠傷寒沙門菌和德爾卑沙門菌是福建省腹瀉病人和健康人群中檢出率最高的兩種血清型沙門菌[14]。近年來這一趨勢有所變化，福建省沙門菌中檢出率最高的血清型是鼠傷寒，其次是腸炎，德爾卑雖仍是本省優(yōu)勢血清型，但檢出率較2003年以前已有所下降[15-17]。健康人群中檢出率最高的沙門菌血清型也仍是德爾卑[17]。另外，福建省鼠傷寒沙門菌在兒童中的檢出率明顯高于成年人；而腸炎沙門菌在兒童和成年人中的檢出率差不多。由此可見，第一，基因sitC和iroN可能與沙門菌的生長繁殖有一定關(guān)系；第二，鼠傷寒沙門菌中可能存在其他替代機(jī)制幫助其攝入鐵離子[5]；第三，沙門菌在兒童和成年人體內(nèi)生長繁殖及致病機(jī)制可能存在差異。上述幾點(diǎn)還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

另一方面，在本省的沙門菌分離株中sitC和iroN的基因攜帶模式在腹瀉病人和健康人群兩個(gè)組別中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，sitC+iroN+及sitC-iroN-都是最為常見的攜帶模式。sitC-iroN-模式的常見也進(jìn)一步說明了其他替代機(jī)制的存在彌補(bǔ)了這些基因缺失所帶來的影響，使沙門菌仍然能在宿主體內(nèi)生存并快速繁殖。

綜上所述，福建省沙門菌分離株中均檢出了一定比例的sitC和iroN毒力基因。這兩個(gè)毒力基因的分布存在血清型差異，但在健康人群和腹瀉病人的沙門菌分離株中不存在分布差異。所以福建省健康人群的沙門菌分離株與腹瀉病人的沙門菌分離株一樣都具有較強(qiáng)的生存能力和一定的致病潛能。因此，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)沙門菌的檢測、預(yù)警，制定科學(xué)有效的防控措施，同時(shí)規(guī)范食品衛(wèi)生管理，加大食品安全相關(guān)知識(shí)的宣傳力度，做好食品從業(yè)人員健康體檢，對(duì)檢出的健康帶菌者應(yīng)勸其及早配合治療并暫時(shí)離開崗位，以避免他們成為疾病的傳染源，造成沙門菌病的暴發(fā)。