躍 華，海 巖，王慧馨，張宇耕，雷 霞，郭衛(wèi)東，張秀紅

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No.2017ZX10103006-003)和內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.201702040)聯(lián)合資助；(躍華和海巖對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者)

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，其主要通過(guò)近距離飛沫傳播，具有高度傳染性，其發(fā)病率居法定報(bào)告?zhèn)魅静〉氖孜?，是第一個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的傳染病。由于流感病毒基因的高度變異性，人群對(duì)其普遍易感，易造成人群反復(fù)感染，發(fā)病率高，可在世界范圍內(nèi)廣泛流行。每次流感流行后，都會(huì)造成不同程度的超額死亡和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，屬正粘病毒科，其基因組由8 條分節(jié)段的RNA片段組成．根據(jù)其核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白(matrixprotein，MP)的特性不同，可將流感病毒分為甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)3型，最近有研究表明，在飼養(yǎng)動(dòng)物(豬、牛) 中發(fā)現(xiàn)了丁型(D) 流感病毒[3-4]。與甲型流感相比，乙型流感不分亞型而根據(jù)其抗原性和基因特征的不同分為2個(gè)譜系，即B Victoria系和B Yamagata系[5]。2017年底至2018年初，中國(guó)流感呈現(xiàn)了一個(gè)高于同期水平的流行高峰，且以B Yamagata系流感病毒流行為主，與此同時(shí)，內(nèi)蒙古自治區(qū)也出現(xiàn)相同的流行峰，為進(jìn)一步了解內(nèi)蒙古自治區(qū)B Yamagata系流感病毒的變異變遷情況，本文對(duì)2015-2018年內(nèi)蒙古自治區(qū)的B Yamagata系流感病毒全基因特征進(jìn)行分析，為乙型流感防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1毒株來(lái)源 本研究選取的2015-2018年B Yamagata系流感病毒株均來(lái)自于內(nèi)蒙古自治區(qū)流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。這些毒株是由各哨點(diǎn)醫(yī)院上送的流感樣病例咽拭子經(jīng)犬腎傳代細(xì)胞(MDCK Cell)培養(yǎng)和(或)雞胚培養(yǎng)后所分離，再由血凝實(shí)驗(yàn)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)復(fù)核確認(rèn)后保存于-70 ℃冰箱。其中，2015年3株，2017年3株，2018年2株。

1.2病毒提取及基因擴(kuò)增 病毒RNA提取采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，具體操作方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)；一步法PCR擴(kuò)增試劑采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2，配置擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，全基因組擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[6]，由上海伯杰生物科技有限公司合成。一步法RT-PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 cycles；72 ℃ 10 min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳核實(shí)擴(kuò)增目的條帶，PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海伯杰生物科技有限公司完成。

1.3全基因組序列拼接與分析 測(cè)序所得片段用DNAStar中的Seqman進(jìn)行拼接，利用NCBI網(wǎng)站中的Blast比對(duì)驗(yàn)證所得的全基因序列，并用MEGA6.0軟件使用Neighor-Joining(NJ)法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建全基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并使用Bootstrap法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000次。分析毒株基因遺傳進(jìn)化特征，并與WHO 推薦的疫苗株與和參比株的核苷酸進(jìn)行比較分析毒株的遺傳性、抗原性、耐藥性等基因特征。分析中用到的疫苗株和參比株序列均來(lái)自GenBank和GISAID網(wǎng)站。

2 結(jié) 果

2.1全基因同源性分析 以WHO推薦北半球疫苗株B/Phuket/3073/2013為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)2015-2018年內(nèi)蒙古自治區(qū)的8株B Yamagata系流感毒株全基因組序列進(jìn)行核苷酸同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有毒株的8個(gè)基因節(jié)段與疫苗株的核苷酸同源性在97.7%～99.9%之間，其中，B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株的NA基因核苷酸序列與疫苗株的同源性相對(duì)較低，分別為97.7%和97.8%，見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)蒙古自治區(qū)B Yamagata系流感毒株與疫苗株同源性分析
Tab.1 Homology analysis of sequences of all genes between B Yamagata viral isolates in Inner Mongolia and the vaccine strain

病毒分離株B/Phuket/3073/2013 (同源性 %)PB2PB1PAHANPNAMNSB/Inner Mongolia/113/201899.499.499.499.199.399.799.299.4B/Inner Mongolia/122/201899.399.599.698.899.399.799.599.2B/Inner Mongolia/1995/201799.499.599.698.899.399.799.498.9B/Inner Mongolia/1588/201799.599.599.098.399.699.799.299.1B/Inner Mongolia/1547/201799.499.399.699.199.699.799.099.1B/Inner Mongolia/1176/201599.799.799.999.699.899.999.799.5B/Inner Mongolia/1200/201599.699.499.199.598.297.799.699.4B/Inner Mongolia/1178/201599.899.399.899.598.297.899.799.5

2.2全基因遺傳進(jìn)化分析 通過(guò)繪制全基因進(jìn)化樹(shù)圖發(fā)現(xiàn)，除NP基因外，其他節(jié)段在進(jìn)化樹(shù)中均形成明顯的B Yamagata系和B Victoria系兩大分枝。內(nèi)蒙古自治區(qū)2015-2018年度的大部分B Yamagata系流感病毒株的各節(jié)段基因在進(jìn)化樹(shù)中共同處于同一獨(dú)立分枝中，且與B/Phuket/3073/2013疫苗株距離較近；但B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015兩個(gè)毒株的NP和NA基因與疫苗株處于不同分枝中，遺傳距離較遠(yuǎn)，且出現(xiàn)HA-BY/NA-BV系間重配現(xiàn)象。HA、NA和NP基因進(jìn)化情況見(jiàn)圖1，其余節(jié)段基因進(jìn)化樹(shù)均與HA類(lèi)似。

2.3 氨基酸序列分析

2.3.1血凝素基因(HA)氨基酸分析結(jié)果 內(nèi)蒙古自治區(qū)2015-2018年B Yamagata系流感病毒株相對(duì)于B/Phuket/3073/2013疫苗株均出現(xiàn)L172Q和D196N變異，2017-2018年毒株均出現(xiàn)M251V突變，其中B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015兩個(gè)毒株相對(duì)于疫苗株還出現(xiàn)T75N、K116R和D232N(近受體結(jié)合位點(diǎn))變異，見(jiàn)表2。

2.3.2神經(jīng)氨酸酶基因(NA)氨基酸分析結(jié)果 由于乙型流感病毒缺乏M2蛋白離子通道[7]，故其對(duì)金剛烷胺類(lèi)藥物不敏感，故神經(jīng)氨酸酶抑制劑為其首選治療藥物。NA基因的一些氨基酸突變會(huì)導(dǎo)致病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感性降低，本次研究發(fā)現(xiàn)病毒株的神經(jīng)氨酸酶活性中心仍保持較高的保守性，其功能部位的氨基酸序列為：E117、R150、D197、I221、H273、R292、N294、R374和G407(B Yamagata Number)[8]，故病毒株仍對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感。

2.3.3HA糖基化位點(diǎn)分析 氨基酸的潛在糖基化位點(diǎn)是通過(guò)N-糖苷鍵結(jié)合在Asn(天冬氨酸)-X-Thr(蘇氨酸)或Asn(天冬氨酸)-X-Ser(絲氨酸)的Asn殘基上形成的。本次研究發(fā)現(xiàn)所有毒株HA蛋白中存在固定的11個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，分別位于：第25、59、145、167、196、303、332、491、517、530和577位，其中第196位位于抗原決定簇190螺旋中，而B(niǎo)/Inner Mongolia/1588/2017、B/Inner Mon-golia/1200/2015和 B/Inner Mongolia/1178/2015毒株在第232位出現(xiàn)D→N突變，增加了一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。NA蛋白中存在固定的5個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，分別位于：第56、64、144、284和463位，而HA-BY/NA-BV重配株則缺少了第463位潛在糖基化位點(diǎn)。

▲ B Yamagata系流感疫苗株, ■B Victoria系流感疫苗株, ●內(nèi)蒙古B Yamagata系流感病毒株，黑體：系間重組流感病毒株圖1 內(nèi)蒙古自治區(qū)B Yamagata系流感病毒基因遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of B Yamagata lineage viruses of Inner Mongolia

表2 內(nèi)蒙古自治區(qū)B Yamagata系流感病毒血凝素基因氨基酸位點(diǎn)變異情況
Tab.2 Mutation sites of amino acid on the hemagglutinin gene of B Yamagata viruses in Inner Mongolia

病毒分離株氨基酸突變位點(diǎn)75a116a172b196c229232251414B/Phuket/3073/2013TKLDDDMGB/Inner Mongolia/113/2018--QN--V-B/Inner Mongolia/122/2018--QN--V-B/Inner Mongolia/1995/2017--QN--V-B/Inner Mongolia/1588/2017--QNANVSB/Inner Mongolia/1547/2017--QN--V-B/Inner Mongolia/1176/2015--QN----B/Inner Mongolia/1200/2015NRQN-N--B/Inner Mongolia/1178/2015NRQN-N--

注: a b c分別表示HA 抗原表位120-loop、160-loop和190-helix處的突變位點(diǎn)

3 討 論

自1983年以來(lái)，乙型流感根據(jù)其抗原性和基因特征分成了Yamagata和Victoria兩大譜系。乙型流感雖然不會(huì)引起世界性大流行，但常常導(dǎo)致流感的局部暴發(fā)，其也是通過(guò)病毒表面蛋白的不斷變異來(lái)改變病毒抗原性，逃避宿主免疫，從而導(dǎo)致不斷的流行[9]。乙型流感的HA基因的抗原決定簇包含了4個(gè)區(qū)域，分別為：120環(huán)(116-137)、150環(huán)(141-150)、160環(huán)(162-167)和190螺旋(194-202)，還包括120環(huán)的第75和77位氨基酸。上述氨基酸的改變會(huì)導(dǎo)致乙型流感病毒抗原發(fā)生漂移甚至發(fā)生轉(zhuǎn)變。本次研究的病毒株在上述區(qū)域中的氨基酸序列相對(duì)保守，相對(duì)于B/Phuket/3073/2013疫苗株均出現(xiàn)L172Q和D196N變異。然而，B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015兩個(gè)毒株除上述2個(gè)位點(diǎn)變異外，還出現(xiàn)T75N、K116R和D232N變異。流感病毒出現(xiàn)具有流行意義的新變異被定義為：在其抗原決定簇上有4個(gè)以上位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換，且替換涉及2個(gè)以上抗原決定簇[10]，故上述2個(gè)毒株可以初步判斷出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象，可進(jìn)一步結(jié)合抗原表型分析來(lái)確定是否為疫苗低反應(yīng)株。流感病毒血凝素糖基化位點(diǎn)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能十分重要，其主要作用是穩(wěn)定血凝素蛋白結(jié)構(gòu)，防止血凝素被水解以及阻礙被抗體識(shí)別等。本次糖基化分析中發(fā)現(xiàn)，8個(gè)毒株HA1區(qū)均有6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，而B(niǎo)/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015毒株還增加了第232位潛在糖基化位點(diǎn)，這些均可導(dǎo)致抗原表位被掩蓋，可能會(huì)造成存在于宿主體內(nèi)的原有抗體不能與抗原位點(diǎn)結(jié)合，成為流感流行的優(yōu)勢(shì)株。本次研究的病毒株NA基因的酶活性中心均保持了高度的保守性，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥位點(diǎn)變異，故奧司他韋、扎那米韋等抗病毒藥物仍是乙型流感的首選藥物。

在同源性分析中發(fā)現(xiàn)，2015-2018年內(nèi)蒙古自治區(qū)的B Yamagata系流感病毒與B/Phuket/3073/2013疫苗株保持高度同源，但B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株的NA和NP基因核苷酸序列與疫苗株的同源性相對(duì)較低，結(jié)合遺傳進(jìn)化樹(shù)圖也可發(fā)現(xiàn)，這兩株毒株的NA和NP基因距離疫苗株較遠(yuǎn)，其N(xiāo)A基因且出現(xiàn)了HA-BY/NA-BV的譜系間重配現(xiàn)象，進(jìn)一步佐證疫苗可能對(duì)其不具有保護(hù)效果。上世紀(jì)80年代起，B型流感NP基因從Ⅲ型進(jìn)化至如今的Ⅱ型，其中B Victoria和B Yamagata系流感病毒的NP基因在Ⅱ型進(jìn)化樹(shù)中交織進(jìn)行[11-12]，在進(jìn)化過(guò)程中上述兩株病毒的NP基因仍?xún)A向于B Victoria系流感，如圖所示，其進(jìn)化距離已和B/Phuket/3073/2013疫苗株相距較遠(yuǎn)，推測(cè)NP基因可能發(fā)生了內(nèi)部重排，或許與其他節(jié)段蛋白的協(xié)同作用有關(guān)，可進(jìn)一步開(kāi)展分子生物學(xué)深入研究。通過(guò)流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)[13]，內(nèi)蒙古自治區(qū)2013年以甲型H1N1流感為流行優(yōu)勢(shì)株，2014年以H3N2流感為流行優(yōu)勢(shì)株，而2015年初B Yamagata系流感成為人群主要流行優(yōu)勢(shì)株，這或許也與本次病毒基因研究發(fā)現(xiàn)2015年的毒株發(fā)生抗原漂移，HA和NA發(fā)生基因譜系間重配，NP發(fā)生基因內(nèi)部重排，而導(dǎo)致人群免疫屏障無(wú)法建立有效保護(hù)有關(guān)。其余6份毒株的8個(gè)基因節(jié)段與疫苗保持了高度同源，同源性均達(dá)99.0%以上，并且在進(jìn)化樹(shù)中同處一分枝中，故可以判斷疫苗對(duì)其具有較好的保護(hù)效果。

由于B Yamagata和B Victoria系流感病毒可在人群中同時(shí)流行，增加了二者發(fā)生基因重配的機(jī)會(huì)，通過(guò)全基因分析發(fā)現(xiàn)本次重配僅發(fā)生在HA和NA基因之間，未見(jiàn)其他基因的重配現(xiàn)象，重配是否影響乙型流感病毒的生長(zhǎng)特性、毒力、致病性等，可進(jìn)一步深入研究。