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血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康、阻礙疫區(qū)經濟發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，是世界衛(wèi)生組織確定的六大熱帶病之一[1-2]。目前我國人畜血吸蟲感染率和感染強度已明顯下降，絕大部分流行區(qū)已達到傳播控制目標，但由于日本血吸蟲宿主多，釘螺分布面積廣，尚不能從根本上阻斷血吸蟲病的流行和傳播[3-4]。DNA疫苗是將編碼特異性抗原的基因重組到真核表達載體，注入機體后可誘導機體產生特異性免疫應答的一類疫苗，具有制備簡易，免疫原性穩(wěn)定等優(yōu)點。研究表明多價DNA疫苗的免疫保護力優(yōu)于單件DNA疫苗[5]。本實驗室彭微等分別從SIEA 26-28kDa和AWA 31-32kDa中克隆出來日本血吸蟲核糖體蛋白S4(SjRPS4)與組織內肽酶B(SjCB)，將其構建為pVAX1/SjRPS4·CB雙價DNA疫苗，該疫苗具有良好的抗日本血吸蟲病免疫保護效果[6-7]。

細胞因子是機體內免疫細胞或非免疫細胞產生的一類具有廣泛生物學活性的異質性肽類調節(jié)因子，具有調節(jié)固有免疫和適應性免疫、損傷組織修復等多種功能。白細胞介素-18 (IL-18)是一種具有重要的免疫調節(jié)和免疫保護功能的細胞因子[8]。研究發(fā)現，IL-18具有免疫佐劑效應，可顯著增強各種抗原的免疫原性，從而明顯提高疫苗接種的效果[9-10]。傳統(tǒng)的細胞因子免疫是體外直接供給細胞因子，維持時間短，所需量大。如以質粒為載體，將細胞因子作為基因佐劑接種機體，可減少細胞因子制備、純化等過程。鑒于此，本研究選用pVAX1/IL-18 聯合pVAX1/SjRPS4·CB疫苗進行動物實驗，以探討pVAX1/IL-18對日本血吸蟲DNA疫苗效果的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 質粒pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18、pVAX1，SjCB蛋白和SjRPS4蛋白，由湘雅醫(yī)學院寄生蟲病學實驗室制備保存；羊抗鼠IgG-HRP、二氨基苯胺(DAB)均為Sigma公司產品；IL-18 ELISA檢測試劑盒為康為世紀生物科技有限公司產品。

1.2實驗動物 SPF級Babl/c小鼠，雌性，體重18g～25g，6周齡，購自湖北市疾病控制中心實驗動物部；陽性釘螺系本室釘螺實驗基地提供。

1.3動物分組及實驗方案 將BALB/C小鼠隨機分為NS組、pVAX1空質粒組、pVAX1/IL-18組、pVAX1/SjRPS4·CB組、pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組，每組12只。每組小鼠在左后腿股四頭肌注射相對應質粒100 μg或者等劑量生理鹽水，隔2周加強1次，共注射3次。末次免疫3周后，經腹部皮膚感染20±1只日本血吸蟲尾蚴。感染后8W解剖小鼠。

1.4pVAX1/SjRPS4·CB免疫學活性鑒定 將純化的SjCB蛋白和SjRPS4蛋白進行SDS-PAGE電泳，低溫轉移至PVDF膜，以實驗小鼠血清作為一抗，以抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)作為二抗，二氨基苯胺(DAB)作為底物進行顯示觀察。

1.5小鼠血清IL-18和抗體IgG的檢測 于小鼠末次免疫后3W斷尾法取血，收集小鼠血清。血清以1∶200-1∶25 600倍比稀釋，用間接ELISA法檢測免疫小鼠IgG抗體。采用康為世紀IL-18 ELISA檢測試劑盒檢測IL-18在各組小鼠血清中的含量。

1.6減蟲率和減卵率 實驗結束后用頸椎脫臼法處死小鼠，采取左心室-門靜脈灌注法收集成蟲，計算減蟲率；將雌蟲夾在兩片載玻片中，輕輕按壓后顯微鏡下計數雌蟲子宮內蟲卵數。取0.5 g肝臟、腸組織，剪碎，與5%KOH溶液37 ℃水浴5～6 h后，取500 μL懸液，顯微鏡下計數蟲卵數，計算每克肝蟲卵數(LEPG)和每克腸蟲卵數(IEPG)。按下列公式計算減蟲率和減卵率。

2 結 果

2.1重組蛋白SjRPS4、SjCB的免疫學活性檢查 Western Blotting結果顯示分別在50 kD左右及32 kD左右處出現陽性條帶(圖1)，表明SjCB與SjRPS4蛋白均可同小鼠陽性血清結合，說明高效重組質粒pVAX1/SjRPS4·CB構建表達成功，重組蛋白具有良好的抗原性。

M：protein marker；1：SjCB與陽性小鼠血清共孵育；2：SjRPS4與陽性小鼠血清共孵育M:protein marker; 1：SjCB incubated with Serum of pVAX1/SjRPS4·CB vaccine and pVAX1/IL-18 group;2：SjRPS4ncubated with Serum of pVAX1/SjRPS4·CB vaccine and pVAX1/IL-18 group圖1 重組蛋白SjCB與SjRPS4的Western blotting分析Fig.1 Western blotting analysis of recombinant SjCB and SjRPS4

2.2血清中IL-18的檢測 ELISA檢測各組小鼠血清中的IL-18細胞因子的水平，發(fā)現pVAX1/IL-18組和pVAX1/SjRPS4·CB + pVAX1/IL-18組小鼠血清中的IL-18細胞因子的水平較pVAX1/SjRPS4·CB或pVAX1空質粒對照組顯著升高(圖2)，表明pVAX1/IL-18質粒可在小鼠體內穩(wěn)定表達。

* P<0.05,與NS或pVAX1組比較* P<0.05, vs, NS or pVAX1圖2 ELISA檢測小鼠血清中IL-18結果Fig.2 IL-18 levels in serum of mice by ELISA

2.3血清中IgG 抗體的檢測 末次免疫3周后斷尾取血，將血清以1∶200-1∶25 600倍比稀釋，按OD450值的比值P/N>2.1 作陽性為標準，得到pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組的抗體滴度為1∶12 800，高于pVAX1/SjRPS4·CB組滴度1∶6 400。血清稀釋度為1∶200的情況下，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組和pVAX1/SjRPS4·CB組的IgG 抗體OD450值分別為1.03±0.17和0.82±0.15高于其他組(P<0.05)，但pVAX1/SjRPS4·CB組與pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組IgG 抗體水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.4小鼠減蟲率及減卵率 pVAX1/SjRPS4·CB組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率分別為36%、52%、50%，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率分別為52%、63%、67%(表1)，兩組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率與NS或pVAX1組比較具有顯著增加，其兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠減蟲率及減卵率
Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group

組別Group平均檢獲成蟲數(條)Mean No. of worms(x±s)減蟲率Worm reduction rates(%)平均LEPGMean LEPG(x±s)肝減卵率Liver egg reduction rate (%)平均 IEPGMean IEPG (x±s)腸減卵率Intestine egg reduction rate(%)NS15.00±0.94-11925.33±1357.18-13491.89±1983.60-pVAX114.40±1.17411662.89±1825.73212528.67±2152.487pVAX1/IL-1812.30±0.82*188756.11±1069.45*2710106.11±1286.49*25pVAX1/SjRPS4·CB9.60±0.97*365680.22±917.50*526746.33±793.53*50pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-187.20±0.79*#524383.00±772.96*#634500.22±604.52*#67

*P<0.05,與NS或pVAX1組比較；#P<0.05,與pVAX1/SjRPS4·CB組比較

*P<0.05, vs, NS or pVAX1；#P<0.05, vs, pVAX1/SjRPS4·CB

2.5每雌減卵率 采取左心室-門靜脈灌注法收集成蟲，將雌蟲夾在兩片載玻片中，輕輕按壓后顯微鏡下計雌蟲子宮內蟲卵數，按公式計算每雌減卵率。由表2可知，pVAX1/IL-18，pVAX1/SjRPS4·CB， pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-18組每雌減卵率分別為7%、36%、52%；pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-18組每雌減卵率與其他組相比，減卵效果明顯(P<0.05)。

表2 血吸蟲雌蟲減卵率
Tab.2 The egg reduction rate of per female worm

組別Group雌蟲數量(條)No. of female worm平均每雌蟲卵數(個)Mean eggs per female worm(x±s)每雌減卵率Egg reduction rate(%)NS10171.00±12.94-pVAX110162.90±14.765pVAX1/IL-1810158.40±10.097pVAX1/SjRPS4·CB10109.90±7.36* 36pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-181081.50±6.52*#52

*P<0.05,與NS或pVAX1組比較；#P<0.05,與pVAX1/SjRPS4·CB組比較

*P<0.05, vs, NS or pVAX1；#P<0.05, vs, pVAX1/SjRPS4·CB

3 討 論

隨著對佐劑作用機制的研究，特別是對免疫系統(tǒng)中各類細胞及細胞因子的深入研究，疫苗佐劑的研制也進入了高速發(fā)展期。細胞因子有著廣泛的生物學活性，具有免疫調節(jié)作用，可調節(jié)和增強DNA 疫苗的免疫反應，是作為疫苗佐劑的理想選擇[11-13]。IL-18是IL-1細胞因子超家族中的一員，主要作用于T細胞、NK細胞，誘導和調節(jié)IFN-γ和IL-12的產生，不僅在抗感染、抗腫瘤方面有重要作用，也參與自身免疫性疾病等多種疾病的病理過程[14-15]。IL-18在日本血吸蟲病的免疫保護、抗病效果等方面也取得了顯著的效果。Zhang等[16]將IL-18基因修飾的肝細胞經脾移植入感染血吸蟲的小鼠，IL-18增強Th1型免疫反應，起到抗纖維化的作用。因此，IL-18成為佐劑研究，特別是作為高效血吸蟲病疫苗佐劑研究的熱點之一[17]。

本研究利用pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18聯合免疫Babl/c小鼠，結果顯示，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組減蟲率、肝減卵率、腸減卵率和每雌減卵率均高于疫苗組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示pVAX1/IL-18對血吸蟲疫苗pVAX1/SjRPS4·CB有較明顯的增效作用。Dupré等[18]在使用IL-18作為佐劑與疫苗共同免疫BALB/c小鼠后，小鼠減蟲率與減卵率分別為23%和28%。Men等[19]構建真核表達質粒pVAX1/mIL-18和pVAX1/Sj23聯合免疫小鼠，小鼠成蟲減蟲率和減卵率明顯高于單獨免疫組，并且可誘導產生較強的IgG，提示pVAX1/mIL-18和pVAX1/Sj23聯合免疫小鼠具有一定的增效作用。本研究也發(fā)現疫苗免疫小鼠后，pVAX1/SjRPS4·CB +pVAX1/IL-18組誘導產生的IgG 抗體水平明顯高于其他實驗組，證明IL-18質粒促進了特異性抗體的產生，從而促進宿主產生了明顯的減蟲和減卵效果。

總之，IL-18作為佐劑在抗寄生蟲方面有重要的作用，與一些疫苗聯合免疫后可誘導產生較高的免疫保護力，但仍需要進一步深入研究其在免疫調節(jié)中的作用機制。