任丹丹，夏媛媛，王秀男，劉 彪，李 強(qiáng)，沈際佳，張玉俠

在我國(guó)血吸蟲病仍是一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1-2]。其主要危害是肝臟的蟲卵性肉芽腫炎癥和隨后的纖維化[3]。肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離、純化和檢測(cè)對(duì)研究蟲卵肉芽腫的細(xì)胞學(xué)及免疫學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。

有相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道采用Ⅳ型膠原酶結(jié)合注射器機(jī)械吹打分離肉芽腫細(xì)胞，但并未提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟，而且尚無(wú)針對(duì)感染不通過(guò)階段(急、慢性期)分離肉芽腫細(xì)胞的優(yōu)化方案[4-7]。本研究結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用Ⅳ型膠原酶兩步消化法處理急、慢性血吸蟲感染小鼠肝臟，通過(guò)流式檢測(cè)肉芽腫細(xì)胞的主要成分以確定分離效果以獲得大量的及保存細(xì)胞表面標(biāo)志物的肉芽腫細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)膠原酶濃度及消化時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，建立了分離急慢性肉芽腫細(xì)胞的有效方法。

1 材料與方法

1.1日本血吸蟲感染模型的建立 C57BL/6，6-8周齡的SPF級(jí)雄性小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。日本血吸蟲陽(yáng)性釘螺購(gòu)自湖南省寄生蟲病防治研究所，以常規(guī)方法逸出尾蚴。C57/BL6小鼠腹部去毛，蓋玻片蘸取尾蚴(20±2條)貼于小鼠腹部。感染后6周或12周處死小鼠。

1.2 肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離

1.2.1脫頸處死小鼠后， 75%乙醇浸泡 3 min，無(wú)菌取出約1 g的肝臟放入青霉素瓶中。

1.2.2加入100 μL下述不同濃度的Ⅳ型膠原酶溶液，眼科剪剪碎肝組織呈糊狀(約10 min)。

1.2.35 mL的生理鹽水重懸剪碎的肝組織，待肉芽腫顆粒自然下沉即吸去渾濁上清，再加入生理鹽水重懸，并吸去上清，如此反復(fù)自然沉淀洗滌，直至上清清澈。

1.2.4收集感染6周的肉芽腫顆粒加入50 mL錐形瓶中：再分別加入10 mL含Ca2+/Mg2+和5%的胎牛血清的0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.2 mg/mL的膠原酶溶液(Ⅳ型Solarbio)，37 ℃搖床消化，210 r/min，30 min；300目細(xì)胞篩過(guò)濾，小鐵勺刮取細(xì)胞篩上的肉芽腫放入新錐形瓶中，再分別加入10 mL的上述濃度膠原酶溶液，37 ℃搖床消化，210 r/min，30 min。

1.2.5將雛形瓶置于冰上3 min終止消化，倒入無(wú)菌皿中，加入適量的完全1640培養(yǎng)基，用5 mL注射器反復(fù)吹，直至肉芽腫顆粒消失，300目細(xì)胞篩過(guò)濾至50 mL離心管中，離心，1 500 r/min，5 min，4 ℃。

1.2.6棄上清，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，冰上10 min，再加入10 mL的不完全1640終止裂紅，上下顛倒離心管混勻。離心，1 500 r/min，5 min，4 ℃，棄上清。不完全1640培養(yǎng)基離心洗滌2次，1 mL完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106～6×106個(gè)/mL，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸液以去除蟲卵，用于流式檢測(cè)。

1.2.7膠原酶消化時(shí)間和濃度的調(diào)整：感染6周小鼠肝臟，先固定消化時(shí)間不變(兩步消化時(shí)間為30/30 min)，改變膠原酶濃度(分別為0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL)，37 ℃搖床，210 r/min進(jìn)行消化，獲取肉芽腫細(xì)胞，標(biāo)記抗體進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果表明0.25 mg/mL為最佳濃度。然后選擇0.25 mg/mL膠原酶濃度來(lái)設(shè)置不同的消化時(shí)間分別為30 min與30 min、40 min與20 min和30 min與20 min，并據(jù)流式結(jié)果確定最佳消化時(shí)間，感染12周小鼠肝臟，分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的酶溶液消化，兩次時(shí)間為40 min與30 min。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肉芽腫細(xì)胞 肉芽腫細(xì)胞5×106個(gè)/管，大鼠血清20 μL，室溫封閉20 min。加入1 μL FITC-CD4抗體/管(BD公司)，4 ℃，避光孵育40 min。染色緩沖液洗滌，350 μL的流式固定液重懸、固定細(xì)胞。流式儀檢測(cè)。

1.4天狼猩紅染色 留取肝臟組織，4%的多聚甲醛溶液固定24 h，浸臘、包埋，切片厚度5 μm，脫蠟至水,做常規(guī)天狼猩紅染色。

1.5數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0 軟件包處理, 三組數(shù)據(jù)比較采用方差分析, 兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肝臟的大體圖 感染6周的小鼠肝臟表面可見(jiàn)很多粟粒樣肉芽腫顆粒如圖1A，而感染12周的小鼠肝臟表面肉芽腫顆粒較多但較小，且肝臟顏色更深，呈深褐色見(jiàn)圖1B。

A. 感染6周； B. 感染12周圖1 小鼠感染血吸蟲后病變肝臟Fig.1 Photography of livers in mice infected with S. japonicum

2.2肝臟纖維化觀察 紅色為天狼猩紅所染的纖維化組織，感染6周的小鼠肝臟肉芽腫見(jiàn)圖2A，此時(shí)肝臟纖維化程度輕、面積較??；感染12周的肝臟，纖維化面積增大見(jiàn)圖2B。

A. 感染6周； B. 感染12周圖2 小鼠感染血吸蟲后的肝臟纖維化(天狼猩紅染色, ×100)Fig.2 Hepatic fibrosis in mice infected with S. japonicum (Sirius red staining, ×100)

2.3獲得干凈的肝臟肉芽腫及肉芽腫細(xì)胞 如圖3A、B所示，第一步膠原酶消化后獲得干凈的肉芽腫。鏡下可見(jiàn)大量圍繞蟲卵的肉芽腫細(xì)胞如圖3B。經(jīng)過(guò)第二步膠原酶消化后獲得干凈的活肉芽腫細(xì)胞見(jiàn)圖3C。

A. 肉芽腫顆粒； B. 肉芽腫顆粒鏡下圖(×200)； C. 肉芽腫細(xì)胞(×400)圖3 肝臟肉芽腫顆粒及肉芽腫細(xì)胞Fig.3 Hepatic granulomatous granules and cells

2.4 流式檢測(cè)肉芽腫細(xì)胞

2.4.1 感染6周的肝臟肉芽腫

2.4.1.1膠原酶濃度的探索 分別采用0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL Ⅳ型膠原酶進(jìn)行消化，消化時(shí)間均為30 min /30 min，獲取肉芽腫細(xì)胞，標(biāo)記抗體后進(jìn)行流式檢測(cè)。結(jié)果表明，0.25 mg/mL酶溶液消化下，可獲得較高比例的CD4+T細(xì)胞且CD4+T細(xì)胞分群明顯如圖4A、B。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4C, *P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，選擇膠原酶最佳濃度為 0.25 mg/mL，用于探索消化時(shí)間。

圖4 不同膠原酶濃度分離感染6周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.4 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.1.2消化時(shí)間的優(yōu)化 在確定膠原酶最佳濃度為0.25 mg/mL后，調(diào)整消化時(shí)間為：30 min /30 min，30 min /20 min，40 min /20 min，粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞流式圖見(jiàn)圖5A。結(jié)果表明，在使用0.25 mg/mL的Ⅳ型膠原酶濃度條件下，第一次消化時(shí)間為30 min，第二次消化時(shí)間為20 min時(shí)，CD4+T細(xì)胞分群最佳，但細(xì)胞比例較低，見(jiàn)圖5B；當(dāng)?shù)谝淮蜗瘯r(shí)間增加至40 min時(shí)，可獲得更多CD4+T細(xì)胞，但CD4+T細(xì)胞分群不明顯，見(jiàn)圖5C；而當(dāng)兩次消化均為30 min時(shí)，可獲得數(shù)量較多且分群明顯的CD4+T細(xì)胞。

圖5 不同消化時(shí)間分離感染6周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.5 Effects of different digestion periods on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.2流式檢測(cè)感染12周小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離效果 血吸蟲感染小鼠隨著病情進(jìn)展，肝臟逐漸出現(xiàn)纖維化，由于大量膠原沉積，此時(shí)分離肉芽腫細(xì)胞應(yīng)該使用更高濃度的酶消化液，消化時(shí)間也應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。再分離急性肉芽腫細(xì)胞得所獲結(jié)果基礎(chǔ)上，分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶消化，第一次消化時(shí)間40 min，第二次消化時(shí)間30 min的條件下，粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞流式圖見(jiàn)圖6A。使用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶溶液，最終分離所獲的CD4+T細(xì)胞難以分群，見(jiàn)圖6B；且不獲得更多的淋巴細(xì)胞，見(jiàn)圖6C。因此，濃度為0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶分離感染后12周肝臟肉芽腫細(xì)胞效果較好。由于已獲得較為滿意的分離效果，對(duì)于消化時(shí)間未做其它調(diào)整。

圖6 不同膠原酶濃度消化分離感染12周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.6 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 12-week infection livers

3 討 論

宿主感染血吸蟲后，機(jī)體會(huì)逐漸產(chǎn)生一系列的免疫防御反應(yīng)，CD4+T細(xì)胞具有重要作用，CD4+T細(xì)胞分化的Th1、Th2、Treg和Th17等細(xì)胞在血吸蟲感染后的不同階段參與免疫應(yīng)答，分泌的細(xì)胞因子相互調(diào)控參與機(jī)體免疫應(yīng)答[8]。在血吸蟲感染動(dòng)物模型中，早期主要形成Th1型免疫應(yīng)答[9]，晚期會(huì)轉(zhuǎn)化，以Th2型細(xì)胞因子為主的免疫應(yīng)答環(huán)境[10-11]；而Treg細(xì)胞已被證明可使血吸蟲感染由急性轉(zhuǎn)為慢性感染[12-13]；Th17細(xì)胞參與了蟲卵導(dǎo)致的急性肉芽腫和肝纖維化，而且IL-17和IFN-γ在血吸蟲感染過(guò)程中相互調(diào)節(jié)[14-16]。因此，獲得足量、純凈的肝臟肉芽腫活細(xì)胞，特別是細(xì)胞表面標(biāo)志保存完整的CD4+T細(xì)胞對(duì)于血吸蟲性肝臟疾病的細(xì)胞學(xué)的研究至關(guān)重要。

Pellegrino等采用勻漿機(jī)破碎肝臟，然后生理鹽水反復(fù)洗滌、自然沉淀的方法獲得肉芽腫組織，缺點(diǎn)是肉芽腫上仍附著有肝組織[17]；Ragheb等采用上述方法獲得肉芽腫組織后，采用Ⅳ型膠原酶和DNase I在37 ℃水浴搖床消化肉芽腫顆粒30～50 min分離曼氏血吸蟲感染8周和20周的CBA/J小鼠[4]。Metwali等采用0.5%的Ⅳ型膠原酶37 ℃水浴搖床消化30～40 min分離曼氏血吸蟲感染8周CBA/J小鼠的肝臟肉芽腫細(xì)胞[18-19]。以上這些分離肉芽腫細(xì)胞的方法存在不同的缺陷：如肉芽腫細(xì)胞不純(含有肝漿)；或是細(xì)胞表面標(biāo)志丟失；或是細(xì)胞的活性降低影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

研究表明日本血吸蟲與曼氏血吸蟲治病力不同，如曼氏血吸蟲感染C57BL/6小鼠僅產(chǎn)生較小的肝臟肉芽腫，而感染CBA/J小鼠則發(fā)生強(qiáng)烈的肉芽腫反應(yīng)，程度與日本血吸蟲感染的C57BL/6小鼠相似，因而上述關(guān)于曼氏血吸蟲肉芽腫細(xì)胞分離方法不適用于分離日本血吸蟲肉芽腫細(xì)胞。本研究在Yole[20]建立的Ⅳ型膠原酶兩步消化法分離肉芽腫細(xì)胞的基礎(chǔ)上，對(duì)膠原酶濃度和消化時(shí)間進(jìn)行探索，建立了針對(duì)日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠急、慢性肝臟肉芽腫細(xì)胞分離的有效方法。通過(guò)第一步膠原酶消化，去除了肉芽腫周圍的肝組織，過(guò)濾后得到了干凈的肉芽腫顆粒；通過(guò)第二步膠原酶消化和注射器機(jī)械吹打，有效地分散了組成肉芽腫的各種細(xì)胞。

感染6周的小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞流式檢測(cè)的結(jié)果顯示，稍高的膠原酶濃度或者過(guò)久的消化，都會(huì)導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞分群不明顯，而過(guò)低的膠原酶濃度也無(wú)法分離出足夠CD4+T細(xì)胞，所以對(duì)于感染了6周小鼠的肝臟，建議采用0.25 mg/mL的膠原酶消化液，兩步消化時(shí)間為30 min/30 min，此時(shí)CD4+T細(xì)胞比例高且細(xì)胞分群明顯。隨著感染時(shí)間的推移，肝臟肉芽腫炎癥由急性感染轉(zhuǎn)化為慢性感染并伴隨有肝纖維化，肝臟的膠原含量會(huì)逐漸增多(天狼星紅染色結(jié)果可見(jiàn))，因此，需要改變膠原酶濃度和消化時(shí)間。結(jié)果表明：分離感染12周的小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞最佳膠原酶濃度為0.3 mg/mL的酶濃度，分離的CD4+T細(xì)胞比例較高，且分群明顯；而使用0.5 mg/mL的膠原酶濃度則會(huì)破壞CD4+T細(xì)胞表面蛋白，且細(xì)胞分群不明顯。

本研究提供的分離肉芽腫細(xì)胞的方法可重復(fù)性好，步驟簡(jiǎn)單易操作；整個(gè)過(guò)程不超過(guò)2 h；不需要淋巴細(xì)胞分離液等試劑輔助純化；可以包括粒細(xì)胞在內(nèi)的組成肉芽腫的主要細(xì)胞群；而且細(xì)胞純度高、活性好(臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活性達(dá)95%)，獲得肉芽腫細(xì)胞，完全可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)(如刺激培養(yǎng)、流式分選等)的要求?？蓮V泛地用于日本血吸蟲肝臟肉芽腫疾病的細(xì)胞免疫研究，特別是為進(jìn)一步研究肉芽腫細(xì)胞中的Th1、Th2、Th17和Treg等輔助性T細(xì)胞的提供了一種可靠的CD4+T細(xì)胞分離技術(shù)。