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目前，在國內研究狂犬病的主要對象是狗和人類，而較少對野生動物進行研究。然而，近年來，狂犬病病毒(RABV)也已從其他野生動物中分離出來，包括貓、狼、狐貍、大鼠、蝙蝠和家畜，牛、豬、羊和梅花鹿等[1-3]。早在1991年初，在我國內蒙古突泉縣[4]，狼突然襲擊了一個村子，咬傷了人，牛和馬。與此同時，在村里發(fā)現(xiàn)許多不明原因的狐貍死亡。在2002和2008，許多類似的案件也發(fā)生在我國浙江省淳安縣和周邊地區(qū)，隨后研究人員從被鼬獾咬傷后死亡的家養(yǎng)動物(狗、貓、豬)中得到狂犬病病毒的全序列[5-6]，同時，在2007，研究人員從內蒙古浣熊狗和紅狐身上分離出狂犬病病毒[7]，2012，韓國科學家在家養(yǎng)的動物(狗和貓)和野生動物(浣熊狗)中檢測到狂犬病病毒[8]。自1986以來，我省根據(jù)流行病學調查資料和臨床診斷結果，20余只家畜在被感染犬或狼咬傷后感染了狂犬病，但是由于實驗條件有限，研究人員沒有得到實驗室資料直到2012和2014年，我們發(fā)現(xiàn)在青海省果洛藏族自治州和玉樹藏族族自治州發(fā)生了類似狼傷人和家畜事件，因此，我們開始收集狗、牦牛脊髓和人類血清和唾液標本的腦組織。對核酸片段進行測序并比較和分析，建立分子進化樹，以確定感染的來源和傳播途徑。

1 材料與方法

1.1收集不同來源的組織樣本 2012—2016年我們從青海省不同地區(qū)共收集了194個樣本，包括果洛州、玉樹州、黃南州、海北州、海西州、海南州、海東市。樣本包括1例患者血清標本，5人唾液，3只牦牛骨髓，和8只狼和其他動物樣本的腦組織(2只貓，1只蝙蝠和3只狐貍)，其余142個樣本由3種犬的腦組織組成(見表1)，第1種是有狂犬病的病犬，有咬傷的人和牦牛，第2種是犬被野狼或狂犬病咬傷，第3種犬是流浪犬或垂死的犬(活的動物是以安樂死的方式處死，死去的動物是取尸體)。

1.2直接免疫熒光法檢測狂犬病病毒 取腦組織或脊髓，均勻的涂印在載玻片上(使用前，將玻璃浸泡在無水酒精中30 min)制成組織壓印片，用丙酮固定10 min，加入狂犬病病毒熒光素標記的抗RABV-N單克隆(Japanese，Chemicon company)和伊文斯藍染料在壓片上，在37 ℃下孵育30 min后，用PBS液洗滌3次，吹干。用90%甘油封閉片，在熒光顯微鏡下，可見針尖大小，點狀，發(fā)綠色熒光的顆粒，疑似高爾基體體(Negri小體)和病毒顆粒[9]。

表1 不同動物樣品的組成
Tab.1 The composition of different animals sample

動物類型樣本數(shù)(只)DFA陽性數(shù)全序列數(shù)犬142305狼831牦牛321人531貓200蝙蝠100狐貍300

1.3核酸提取與逆轉錄反應 用TRIzol 法(Ambion, USA)[10-11]從腦組織和脊髓中提取總RNA。Oligo-dT (TaKaRa, Japan)作為一個隨機引物，用Ready-To-GoTMYou-Prime First-Strand Beads kit (GE Healthcare, UK)為逆轉錄反應試劑，根據(jù)試劑盒說明書對mRNA進行第一鏈cDNA的合成。

1.4PCR引物 通過參照NCBI庫中8個毒株(AY956319.1, AF499686.2, EF437215.1, HE802676.1, HQ450386.1, KC171645.1, KF155000.1, NC001542.1)的基因組保守區(qū)序列設計了7對外引物和7對內引物(見表2)，由上海生物工程有限公司合成。

1.5PCR 擴增 用合成的cDNA為模板，用GoTaq Green Master Mix Kit (Promega, USA)對7對外引物和7對內引物片段進行擴增，巢式PCR條件[12]如下：第1次擴增：94 ℃，預變性3 min，94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 40 s，共34個循環(huán)。第2次擴增為94 ℃，預變性3 min，94 ℃ 30 ℃，56 ℃ 40秒，72 ℃ 30 ℃，35次循環(huán)，72 ℃ 10 min，用1.5%瓊脂糖凝膠120 V，30 min電泳，用TaKaRa (100 bp-2 000 bpDNA)Markers進行鑒定擴增產物。如果樣本顯示陽性條帶，將其切下用于下一步的實驗。

表2 本文中使用的引物序列
Tab.2 Primer reference sequences used in this study

命名引物序列核苷酸數(shù)退火溫度位點長度1rabiesF1acgcttaaca acaagatcaa agaagaa2762.71rabiesR1ccctggag(A)gg ttaggaaagt tgac2464.519271927rabiesR2ttgtctgact atctggactc caacatt2762.718341834rabiesF3gaagataatc aggctcatct ccagg2562.716101rabiesR3gatgtcccca gtctcggatt ctc2363.739402331rabiesF4caagtatcga gaagactttc agatggat2863.21738rabiesR4atatctgggg tcaccggcca t2165.037011964rabiesF5ggg(A)aaattcc ccatctacac gatac2564.33375rabiesR5tg(A)gaacaatt g(A)tctgtcagg gtcat2564.556242250rabiesF6tcc(T)tacatgg aacttaaagt gggataca2864.13501rabiesR6tagtca(G)gaat tcctcaa(G)gat gttggg2563.155202020rabiesF7tgaaggacat aagcaatagc ttacaatca2964.55260rabiesR7c(T)ccgatgagg tctgatct(G)gt ctga2465.174232164rabiesF8gtacataatt ataaagggct gggtcatct2963.65308rabiesR8tcctct(C)gtt(C)g actccaatct(G) ttgatg2668.873112004rabiesF9gacttgataa ttggtcttaa accaaagga2964.47016rabiesR9ccgtatatgt tgacaggg(A)aa gatggt2664.896452063rabiesF10tggccaacta catcctgcca(C) ctt(C)t2466.87128rabiesR10gccactaaga tt(C)gaatataa gagcccct2865.595912464rabiesF11catgtttcag ccattgatgc tttatg2665.19262rabiesR11ctctc(T)tgcat ctcactcttt(C) ggg(A)ct2565.4111411880rabiesF12agaatatcta gaatggtttc tggagct(G)gt2963.59440rabiesR12gctacaattg aacaacacaa ggctcat2765.2111161677rabiesF13agtgatagat tttgactcca tctggga2763.910684rabiesF14cagaagttac tgacatc(T)gca tctatcaa2863.5108061123rabiesR14acgcttaaca aataaacaag aaagataaaa a3163.5119281245

1.6cDNA測序 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0 (TaKaRa) 試劑用于熔化和純化切下的含DNA片段的瓊脂糖，用得到純化DNA作為模板，用BigDye Terminator v. 3.1 kit (Applied Biosystems, USA)進行了測序反應擴增，擴增的片段通過Performa DTR Gel Filtration Cartridges kit (EdgeBio, USA)進行純化，(上述實驗參照試劑盒說明書)，用ABI 3500基因分析儀進行序列測序。

1.7序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 用ATGC軟件 (GenetyxCo. Tokyo, Japan)校準測序的序列片段，用DNAstar (5.01 version, Laser gene,USA)軟件用來拼接序列，The Clustal X 軟件[13]用來進行全序列比對，用Mega 2軟件包中的The Neighbor Joining(NJ)法[14]構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用1000個Bootstrap(BP)復制方法估計bootstrap neighbor-joinin tree 的可靠性。

2 結 果

2.1狂犬病病毒抗原檢測 在2012—2016年間，我們從青海省玉樹、黃南、果洛、海北、海西、海東市等地獲得了194個動物腦組織標本，其中有牦牛骨髓、家犬腦組織和自然死亡狼腦組織標本等均用于制成組織壓印片。在熒光顯微鏡下，我們觀察到不同大小帶熒光的點和點狀物，見(圖1)，從這194種不同的動物獲得38個DFA陽性結果。

(a)狂犬病病毒抗原陰性犬腦組織；(b)狂犬病病毒抗原陽性的2014狼腦組織；(c)狂犬病病毒抗原陽性2014年牦牛脊髓；(d)狂犬病病毒抗原陽性2014犬腦組織圖1 直接免疫熒光法(抗狂犬病病毒N單克隆抗體)檢測狂犬病毒核蛋白抗原Fig.1 Detection of rabies virus nucleoprotein antigens by direct immunofluorescent assay with anti-rabies virus N monclonal antibody

2.2流行病學分析 在2012和2016年間，分別在青海省果洛藏族自治州瑪多縣扎陵湖和鄂陵湖附近，家犬和羊群被狼咬傷后不明原因死亡，同時，兩主人被自家的犬咬傷繼而感染了狂犬病而死亡，2014年，青海玉樹藏族自治州稱多縣仲達鄉(xiāng)和拉卜鄉(xiāng)，發(fā)生了許多類似的疫情，因為狼咬犬，犬感染狂犬病后咬傷牦牛和羊，同時，人們在村里發(fā)現(xiàn)了野狼的尸體。在4年的時間里，我們得到了38個陽性樣本，它們主要分布在玉樹和果洛藏族自治州(見圖2)，在海北州或西寧地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣本，大部分DFA陽性標本分布在青海省西部和南部，而且DFA陽性樣品的分布趨勢是由西向東遞減。在相鄰的省份西藏和甘肅，在2012年和2013年，也有狂犬病發(fā)生的報告，但是對于2013年來自甘肅的CGS1301D.GS株，屬于 China I 型[15]，它與青海得到的序列不是相同的基因型別。根據(jù)流行病學區(qū)域分布數(shù)據(jù)，青海省狂犬病病毒的傳播途徑為西向東。在時間分布上，陽性率主要在2014和2015年，陽性樣品26個，占總陽性樣品的68.42%，2016年開始的陽性病例在減少，主要是因為我省牧區(qū)開展家養(yǎng)犬定期接種疫苗和對瘋狗捕殺的工作。

圖2 青海地區(qū)DFA陽性數(shù)和樣本的區(qū)域分布圖Fig.2 The regional distribution of DFA-positive case and samples in Qinghai province

2.3核酸序列分析 通過對38個DFA陽性標本進行核酸序列片段的擴增和測序，通過生物信息學軟件將序列直接連接在一起，最終獲得8個全長基因組的核酸序列，(其余的樣品由于核酸濃度較低，未測序成功)。這8個核苷酸序列提交到GenBank后得到的登錄號為：(KY982923、KY99752、KY982922、KY912036、KY952220、KY952219、KY964 323和KY964 322)?？袢〔《镜幕蚴堑湫突蚪M結構，它由N-P- G-G-L片段組成，第一個開放閱讀框(ORF)編碼核蛋白(NP)開始于75(CQHY2014W)，76(CQHM2016D，CQHY2014D150，CQHY2016D)，78(CQHY2014Y)和79(CQHM2012-，CQHY2014D-Y，CQHM2016H)位氨基酸，長度為1 350 bp，編碼區(qū)起始于ATG密碼，終止于TAA或TGA；PP143-148具有高度保守的DKSTQT結構域，保證和Dynin相互作用。在細胞質中，在含有結構脯氨酸PPEY的MP 45-48中，確保功能基的結構不改變；55-58 NLS的GP糖基化位點，265-267的DET，33 3-335 KVS，35-340的NKT，通過分析，我們發(fā)現(xiàn)這8個核苷酸序列中相似性和我們實驗室在2012年提交的序列CQH2012D(KM27 2192.1)的相似性在95%-100%，在序列結構上沒有差異(見表3)。

表3 狂犬病全序列標本基本情況
Tab.3 The basic situation of whole sequence rabies specimen

實驗室編號宿主樣品類型樣品編號時間收錄號其他2012humanghumansurmerCQHM2012H2012.12KY982923Bitten by dog2014dog-YakdogbrainCQHY2014D-Y2014.4KY997452dog-Yak2014Yakcattlespinal cordCQHY2014Y2014.4KY9829222014dog-150dogbrainCQHY2014D1502014.10KY9120362014wolfwolfbrainCQHY2014W2014.11KY952220Natural death2016dogdogbrainCQHM2016D2016.11KY952219Dog-human2016humanhumansalivaCQHM2016H2016.11KY964323Bitten by dog2016ysdogdogbrainCQHY2016D2016.6KY964322

2.4核苷酸序列的進化分析 我們比較了8株狂犬病病毒開放閱讀框(ORF)的G基因和N基因核苷酸序列與來自GenBank中的中國和世界各地35株N基因和38株G基因序列，構建NJ(NJ，復制= 1000)進化樹，但N基因和G基因的結果相同。本研究以8個N基因序列和分別來自我省2012年的CQH2012D株(KM27 2192.1)和來自西藏的2012年的CXZ1201D犬(KC46352)株，它們形成一個獨立的分支(圖3)。按照中國狂犬病病毒分成6個主要基因型(China I-China VI)[15-16]作為參考，我們得到的8個核苷酸序列屬于China Ⅳ，與Arctic-like2類病毒高度相關，其中包括2008年在內蒙古分離的neimeng925(FJ415313)和neimeng1025b(EU652445)，這些分離株具有非常密切的親緣關系，他們和在中國其他流行地區(qū)分離到的基因型別(Ⅰ-Ⅱ)[9]有很大的區(qū)別，(見圖3)。雖然我們沒有足夠的證據(jù)發(fā)現(xiàn)我國有獨立持續(xù)存在野生動物中的狂犬病，以前的研究表明所有的結果都是狼的狂犬病是從狗溢出引起的[7]。然而，根據(jù)序列的相似性和流行病學的數(shù)據(jù)分析，表明狂犬病毒在中國青藏高原地區(qū)的傳播途徑是家養(yǎng)動物和人被野生狼或瘋犬咬傷后發(fā)病。

“紅點”是青海省疾病預防控制中心提交序列，“綠點”是中國疾病預防控制中心提交序列。圖3 基于中國狂犬病病毒和世界其他國家狂犬病病毒N基因開放閱讀框(ORF)核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree base on the open reading frame(ORF) nucleotide sequences of the N geneof Chinese rabies viruses and those from other countrie in the world

3 討 論

在我國狂犬病病例的報道中大多數(shù)是犬類，相對較少發(fā)生在牛中[17]。然而，在我國牛的狂犬病也有少量報道，曾發(fā)生在新疆和河南省[18-19]。近年來，韓國和其他地方有狂犬病發(fā)生在家養(yǎng)動物和野生動物上的報道[20-22]，在我們的研究中，在青海省的人和不同動物組織樣品(牦牛、狼、狗)中檢測到狂犬病病毒。在我們此次的調查中表明狂犬病可以從被野狼咬傷的家養(yǎng)狗傳播給家養(yǎng)的牦牛和人，通過青?？袢∽罱餍汹厔荼砻鳎吧睦强梢栽谥袊鞅眰鞑タ袢?。

在中國狂犬病的基因型中，目前ChinaⅠ型為優(yōu)勢型別，其中80%分布在19個省(自治區(qū)、直轄市)，ChinaⅡ型遍及全國7個省(自治區(qū)、直轄市)。然而，中國的Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ組相對發(fā)生率較低，其分布區(qū)域相對有限[9]，我們對本研究獲得的8個核酸序列進行了G、N基因核苷酸序列的同源性和進化分析，比較他們與西藏犬XZ1(2012)與和蒙古野生動物的親緣關系，發(fā)現(xiàn)了同屬于Arctic-like 群，該群主要分布在世界的北極地區(qū)，以及亞洲西部、俄羅斯、內蒙古、韓國等國家和地區(qū)，并在野生動物中發(fā)現(xiàn)[18]，我們此次從青藏高原地區(qū)的家畜和野生動物中分離出 Arctic-like2病毒。他們都屬于中國Ⅳ組。I. V. Kuzmin在他的研究[23]表明喜馬拉雅山脈和西藏的山區(qū)可能是野生動物中病毒種群的自然屏障，但我們在研究中發(fā)現(xiàn)的證據(jù)表明狂犬病可以打破這種自然屏障。我們所獲得的序列和2012年從CXZ1201d(KC465372)序列高度相似，這一結果表明Arctic-like2病毒分布在中國的西北部青藏高原地區(qū)。此外，由青海病毒陽性的地區(qū)分布表明，提示青海由西向東傳播狂犬病的趨勢與野生動物由西向東的遷移可能有一定關系。

青海位于中國西北部的青海西藏高原、果洛藏族自治州和玉樹藏族自治州位于青海省南部，與玉樹與西藏、四川、新疆和其他省份接壤。本研究中，38個陽性樣品主要分布在玉樹州稱多縣和果洛州瑪多縣扎陵湖和嶺湖，牦牛是青海-西藏高原上較為常見和優(yōu)質的家畜，由于其對青海惡劣生態(tài)條件的適應性強，高山草場和雪地是這些草畜不可缺少的，牦牛在天然草地上放養(yǎng)，使它們易受野生動物傷害。牧民靠放牧牦牛和羊群為生，犬被用來保護主人和家畜。當狼攜帶狂犬病并咬傷家畜，如犬時，犬會攜帶狂犬病，那么主人也會被狗咬傷后死于狂犬病。在青藏高原上有許多野生動物，主要包括狼、紅狐、棕熊、雪豹、土撥鼠等。2009年，約翰遜[24]在土耳其發(fā)現(xiàn)狐貍、牛、貓、松鼠和其他野生動物的狂犬病。2015年中國畜牧業(yè)發(fā)表的一項研究指出，在我國北方浣熊狗可以傳播Arctic-like狂犬病病毒給人和動物。最近的研究表明，其他野生動物(田鼠、狐貍和蝙蝠)也能傳播狂犬病病毒[25]，在我們的研究中，我們收集了貓、狐貍和蝙蝠的樣本，但沒有發(fā)現(xiàn)陽性標本。這些結果表明，我們應該加強在中國西北地區(qū)狂犬病的研究和密切關注其他病毒基因型的傳播。

(致謝：作者在盧茁壯博士的指導和幫助下完成了所有的實驗室工作和引物設計。盧茁壯博士來自中國疾病預防控制中心，擔任青海項目官員的國家顧問。他在我們實驗室工作了一年，參與和指導我們的實驗市工作。此外，我們還得到了我省的州、縣疾病預防控制中心在樣本采樣和流行病調查工作的支持，在此一并致謝！)