高志強(qiáng) 汪琳 蒲靜 尹羿 張偉 趙相鵬 姚震宇

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，北京 100026）

近些年來，動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量和安全成為公眾關(guān)注問題，其中動(dòng)物產(chǎn)品摻假是一個(gè)嚴(yán)重的問題，一些商家為賺取利潤，常使用便宜劣質(zhì)的馬肉、豬肉、鴨肉、雞肉甚至鼠肉來代替高品質(zhì)牛羊肉，如歐洲出現(xiàn)的馬肉丑聞和一些以禽肉代替牛羊肉的摻假案例。由于摻假肉品可能含有導(dǎo)致發(fā)生過敏反應(yīng)的動(dòng)物源性成分，而且某些肉品對于特定的宗教被視為禁忌，因此動(dòng)物產(chǎn)品摻假問題已經(jīng)給人民健康、文化和宗教信仰帶來很大風(fēng)險(xiǎn)。

不同動(dòng)物源產(chǎn)品的外觀本身具有一定相似性，而且經(jīng)過一定的工藝處理，難以從肉眼上進(jìn)行鑒定。目前動(dòng)物源性成分鑒定主要采取分子生物學(xué)方法進(jìn)行，檢測方法包括核酸探針法，PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR法。由于線粒體DNA（mt DNA）種屬特異性較強(qiáng)，可以對動(dòng)物進(jìn)行種屬鑒定，目前多數(shù)核酸檢測方法針對mt DNA，這些mt DNA包括細(xì)胞色素b（Cyt b），18S核糖體DNA，12S rDNA以及細(xì)胞色素C氧化酶亞單位I基因等［1-3］，目前發(fā)布的動(dòng)物源性成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)均針對線粒體DNA［4］。但目前也建立了一些針對動(dòng)物基因組相對保守且能進(jìn)行種屬鑒定的區(qū)域進(jìn)行檢測的方法，這些基因包括衛(wèi)星DNA，生長激素基因，白細(xì)胞介素2前體基因等［5-7］。在定量檢測動(dòng)物物種成分時(shí)，還需選擇一個(gè)基因拷貝數(shù)相對固定的內(nèi)參基因，便于比例計(jì)算和校正誤差，一般選擇在哺乳動(dòng)物和禽類間保守的序列，這些序列包括線粒體DNA，生長激素基因，beta肌動(dòng)蛋白以及肌肉生長抑制素基因等［2-3］。

由于基于核酸擴(kuò)增的檢測方法靈敏度都很高，而不同種動(dòng)物產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工和處置過程中，難免出現(xiàn)肉品間相互交叉污染，因此不能單純依據(jù)定性基因檢測結(jié)果作出摻假的判斷結(jié)論。歐盟發(fā)布的2013/99/EU規(guī)則，規(guī)定如果特定肉產(chǎn)品中含有＞1%的其它肉品成分認(rèn)為是摻假。因此為避免上述假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，在檢測一些動(dòng)物產(chǎn)品時(shí)，有必要對動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量［8］。采用熒光PCR對線粒體和核內(nèi)染色體DNA和線粒體DNA進(jìn)行定量檢測的方法均有報(bào)道［1-7］。但未見在對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品充分前處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物源性成分定量檢測的報(bào)道。

考慮到不同樣品可能含水量不同，直接提取DNA檢測可能造成較大誤差，因此本研究中，以牛肉作為檢測目標(biāo)，通過將檢測樣品凍干、粉碎，并制備一系列具有不同含量被檢目標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)品肉粉，同時(shí)分別提取DNA，應(yīng)用建立的哺乳動(dòng)物和禽通用型、牛源性成分實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測方法，對動(dòng)物產(chǎn)品中牛源性成分進(jìn)行檢測，以期實(shí)現(xiàn)對肉品中牛源成分的精準(zhǔn)檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 常見肉類包括雞肉、牛肉、馬肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、魚肉及兔肉，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304），購自天根生化科技有限公司；Ex HSTaqDNA聚合酶、dNTP等購自TaKaRa公司。核酸純化柱及套管，購自上海生工。

1.1.3 主要設(shè)備 LightCycler 480，Roche公司；微量核酸濃度測定儀Nano quant，TECAN公司；凍干機(jī)，SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的合成 合成以下3套引物探針，其中牛源引物探針針對衛(wèi)星IV DNA［1］，哺乳動(dòng)物和禽通用型引物探針針對肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）［2］，引物探針名稱、序列及靶基因見表1。

表1 引物、探針的名稱、序列及靶基因

1.2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品制備、樣品前處理和DNA提取 將各種動(dòng)物肉類去除脂肪、筋膜后與收集樣品于凍干機(jī)中冷凍干燥24 h以上，于粉碎機(jī)中充分粉碎后制成粉末。以雞肉為摻入基質(zhì)，配制含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)分別配制含15%，8%和1%的牛源成分的凍干肉粉進(jìn)行定量方法驗(yàn)證測試。精確稱量上述標(biāo)準(zhǔn)品和樣品凍干粉25 mg于1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明書提取凍干粉基因組DNA，洗脫DNA于100 μL無核酸酶的純化水中，保存于-80℃。

1.2.3 DNA濃度測定與稀釋 測定前，取2 μLDNA溶液使用Nano quant分別測定260 nm及280 nm之吸光度值（OD）。計(jì)算DNA濃度和純度，其比值應(yīng)介于1.7-2.0之間，根據(jù)測定結(jié)果將各個(gè)DNA樣品稀釋至 20 ng/μL。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 于ROCHE480設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化，對反應(yīng)參數(shù)，各種成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測牛源以及通用型雙重反應(yīng)體系，其中通用型檢測通道作為內(nèi)對照。體系優(yōu)化后，使用4%的瓊脂糖凝膠對陽性（牛肉DNA為模板）和陰性（植物DNA為模板）PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，觀察特異性反應(yīng)條帶。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 應(yīng)用建立的雙重反應(yīng)體系對含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證方法的靈敏度。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的雙重反應(yīng)體系對常見肉類包括雞肉、牛肉、馬肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、魚肉及兔肉進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 通過對25%、10%和1%共3個(gè)含不同濃度牛源成分凍干粉進(jìn)行3次重復(fù)檢測，通過計(jì)算△Ct標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）來確定方法的可重復(fù)性。

1.2.8 熒光定量PCR方法的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和應(yīng)用 為評(píng)估定量方法的實(shí)用性和特異性以及方法的實(shí)用性，應(yīng)用定量標(biāo)準(zhǔn)品和自制的3份牛源成分含量分別為15%、8%和1%（編號(hào)為B15，B8和B1）的模擬樣品及6份送檢牛肉樣品（S1-S6）提取的DNA進(jìn)行上機(jī)檢測，每個(gè)DNA樣品上樣5 μL（即DNA總量100 ng），同時(shí)設(shè)水對照和陰性對照，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣品核酸設(shè)3個(gè)重復(fù)。求取各組Ct值的平均值，將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的檢測Ct值平均值減去內(nèi)部對照基因Ct值平均值后所得之?dāng)?shù)值△Ct為縱軸，以含不同濃度牛源成分標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫軸，進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸系數(shù)（R2）和PCR擴(kuò)增效率［9］。然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對各個(gè)樣品進(jìn)行定量，通過計(jì)算樣品的標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)差來評(píng)價(jià)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化確立反應(yīng)體系：每個(gè)反應(yīng)體系均包含1×Ex HS PCR Buffer，200 nmol/L dNTP，0.5 μmol/L的牛源上下游引物，0.4 μmol/L的通用型上下游引物，0.25 μmol/L的牛源檢測探針以及0.2 μmol/L的通用檢測探針。

反應(yīng)參數(shù)為 95℃ /3 min；94℃/15 s，60℃ /35 s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)60℃時(shí)分別收集FAM和VIC通道熒光信號(hào)。對（牛肉DNA為模板）和陰性（植物DNA為模板）PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，陽性PCR產(chǎn)物可以觀察到大小分別約為87 bp和76 bp的特異性條帶，見圖1。

圖1 雙重?zé)晒釶CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用建立的雙重反應(yīng)體系可以檢出牛源成分含量為0.1%的凍干肉粉（圖2），表明方法的靈敏度可以滿足要求。

圖2 雙重?zé)晒釶CR方法檢測牛源成分的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用檢測牛源性成分以及通用型反應(yīng)體系對常見肉類進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示建立的雙重檢測方法與其他肉類無交叉反應(yīng)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，表明方法的重復(fù)性可以滿足要求。

表2 方法對含不同濃度牛源成分凍干粉檢測的重復(fù)性

2.5 熒光定量PCR方法的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

對制備的含牛源成分的凍干肉粉定量標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果見圖3。檢測結(jié)果經(jīng)計(jì)算后進(jìn)行線性回歸，相關(guān)數(shù)據(jù)及獲得的方程圖形見圖4和表3?；貧w的相關(guān)系數(shù)R2為0.966，PCR反應(yīng)效率（E）=（10-1/k-1）×100%=93.6%，表明建立的方法擴(kuò)增效率較高。

圖3 含100%、50%、25%、10%及1%牛源成分的凍干肉粉定量標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果

2.6 對模擬和送檢樣品的檢測應(yīng)用

3份含不同牛源成分的自制模擬樣品和6份送檢牛肉樣品的檢測結(jié)果見表4，本方法檢測的結(jié)果與自制模擬樣品的已知值非常吻合，而且對于送檢的6份牛肉樣品，計(jì)算牛肉含量為99.55%-100.18%。所有檢測結(jié)果的RSD均小于5%。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程圖形

表3 定量標(biāo)準(zhǔn)品檢測相關(guān)數(shù)據(jù)

表4 模擬和送檢樣品檢測結(jié)果

3 討論

由于基因擴(kuò)增的檢測方法靈敏度都很高，因此定性檢測結(jié)果不能排除不同種動(dòng)物產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存及運(yùn)輸過程中的微量污染問題。因此本研究以牛肉產(chǎn)品為目標(biāo)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取牛衛(wèi)星IV DNA和哺乳動(dòng)物和禽保守的肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）作為檢測目標(biāo)［1-2］，建立了雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物產(chǎn)品中牛源成分的定量檢測。經(jīng)對自制模擬樣品和送檢牛肉樣品進(jìn)行檢測，取得滿意結(jié)果。由于不同來源動(dòng)物制品制作過程和儲(chǔ)運(yùn)條件的不同，因此含水量不同，為提高定量方法的準(zhǔn)確性并盡量減少誤差，本研究采用了在前處理過程中先將樣品進(jìn)行冷凍干燥并充分粉碎，同時(shí)制備出含有不同牛肉成分的標(biāo)準(zhǔn)凍干粉，使用分析天平準(zhǔn)確取樣來消除樣品間的差異。此外，在進(jìn)行DNA提取時(shí)，不同來源樣品提出的DNA的量也可能存在差異，因此需要在擴(kuò)增前測定其含量和純度，并在測量后調(diào)整DNA濃度至同一水平，這樣可很大限度減少上樣誤差。另外，為保證檢測Ct的一致性，每次檢測都應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣品DNA同時(shí)上機(jī)，通過標(biāo)準(zhǔn)品的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線來對樣品中動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量。以前的研究中，雖有采用熒光PCR對動(dòng)物源成分進(jìn)行定量檢測的方法，但這些報(bào)道均未具體描述對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的前處理過程，只是對DNA的濃度進(jìn)行定量。本研究則以制備的不同百分含量的牛肉粉作為標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)將被檢樣品凍干粉碎，提取DNA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)牛源成分的定量，對模擬樣品和送檢牛肉的檢測結(jié)果顯示，比較準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)了模擬樣品和送檢牛肉中牛源成分的定量。

有研究表明肌肉生長抑制素基因在哺乳動(dòng)物和禽細(xì)胞中的拷貝數(shù)比較固定［2］。為監(jiān)控核酸擴(kuò)增中的誤差，本研究使用了肌肉生長抑制素基因作為內(nèi)對照，有效校正了擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的誤差，取得滿意效果。可以進(jìn)一步應(yīng)用本研究的思路開展其他動(dòng)物源成分的定量檢測。由于本研究所檢測的樣品均為生的動(dòng)物產(chǎn)品，DNA基本未被破壞，因此效果較好。有研究表明深加工的熟制動(dòng)物產(chǎn)品如阿膠等，其DNA破壞比較嚴(yán)重［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)同樣的問題，對于這樣的動(dòng)物產(chǎn)品，本研究建立的定量方法可能并不適用，需要針對其他類型靶標(biāo)（如某種相關(guān)的蛋白分子）研究定量檢測方法。本研究僅是對模擬混合牛肉和送檢牛肉進(jìn)行了檢測，樣品均為生鮮肉，距離作為標(biāo)準(zhǔn)方法還有一定距離，進(jìn)一步擴(kuò)大檢測樣品類型，特別是增加一些非深加工的熟肉制品，其他類型組織來驗(yàn)證方法對有效性將是下一步的研究目標(biāo)。此外，牛肉脂肪含量相對較低，DNA分布比較均勻，可能也是取得滿意結(jié)果的原因之一，對于脂肪含量高且分布不均勻的動(dòng)物源性成分能否采用本檢測方法的策略也需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)論

選取牛衛(wèi)星IV DNA和肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）的作為檢測目標(biāo)，建立了雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法，并使用含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，對自制混合肉品和送檢肉品中牛源成分進(jìn)行了定量檢測，取得預(yù)期結(jié)果。