張 煒，杭柏林，董萌萌，胡 斌，徐彥召，張慧輝，胡建和

（河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

防御素（defensins）是一類陽離子多肽，是抗菌肽家族中的重要成員，有多種生物學(xué)活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能，且不易產(chǎn)生耐藥性，其應(yīng)用前景巨大[1-2]。防御素分布廣泛，如哺乳動物、昆蟲和植物等生物體內(nèi)。根據(jù)二硫鍵連接方式的不同和半胱氨酸殘基位置的差異，將防御素分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素三大類[3-4]，其中β-防御素的抗菌活性高效、抗菌譜廣，如抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲等，對一些耐藥性細菌也具有抑殺活性[5-6]，但作用機制稍有差異，如hBD2可作用于結(jié)核分枝桿菌的細胞膜，而hBD3抑制葡萄球菌細胞壁的生成[7]。β-防御素的抗菌活性易受到離子種類和濃度的影響，如hBD2的殺白色念珠菌活性與鹽離子濃度關(guān)系密切[8]，合成的bBD-1對鹽敏感，在低鹽離子濃度時，對乳腺炎大腸桿菌分離株有抑殺活性，但對乳腺炎葡萄球菌分離株的抑殺作用較弱[9]。

防御素專業(yè)網(wǎng)站（http://defensins.bii.astar.edu.sg/）收集了不同生物的防御素，共363種，其中牛源防御素共17種，均屬于β-防御素[10]。TAP是從牛氣管黏膜上皮中發(fā)現(xiàn)的牛的第一個防御素[11]。牛源防御素類抗菌肽可分布于體內(nèi)不同組織部位，如TAP可分布于牛的氣管和肺泡巨噬細胞，BNBD5可分布于中性粒細胞、氣管、肺泡巨噬細胞，bBD可分布于牛的乳頭黏膜、腎、陰道、卵巢、結(jié)腸等[12]。不同的牛源防御素類抗菌肽有著不同的抗微生物活性，如BNBD4和BNBD5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑殺活性[13]，TAP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌具有較好的抑殺活性[12]，LAP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌具有較好的抑殺活性[14]。

本研究利用在線生物信息學(xué)軟件對牛源防御素類抗菌肽的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、磷酸化和糖基化位點等特征進行了分析，結(jié)合已知牛源防御素類抗菌肽的生物學(xué)活性，初步分析牛源防御素類抗菌肽的作用機制，為深入研究與應(yīng)用牛源防御素類抗菌肽提供更多的信息基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 抗菌肽氨基酸序列 牛源防御素類抗菌肽的氨基酸序列主要來自于文獻[10]，其序列如表1所示。

表1 牛源防御素類抗菌肽的氨基酸序列Table 1 Amino acid sequence of AMPs in bovine defensins family

1.2 生物信息學(xué)分析方法 利用ProtParam進行理化性質(zhì)的分析，利用SOMA進行二級結(jié)構(gòu)分析，利用NetOGlyc 4.0 Server進行糖基化分析，利用NetPhos3.1Server進行磷酸化分析，利用Target P 1.1 Server進行亞細胞內(nèi)定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛源防御素的理化性質(zhì) 從表2中可以看出，牛源防御素類抗菌肽由37～42個氨基酸殘基構(gòu)成；除了LAP、BNBD2、BNBD3、BNBD4和BNBD6的等電點大于10之外，其余牛源防御素類抗菌肽的等電點均大于9且小于或等于10（除BNBD1的等電點小于9），但仍然能表明這些抗菌肽應(yīng)帶正電荷；通過分析牛源防御素類抗菌肽的帶電荷氨基酸數(shù)目，發(fā)現(xiàn)帶正電荷氨基酸數(shù)目較多，最多的達10個正電荷氨基酸殘基，而帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)較少乃至缺乏，總體而言，牛源防御素類抗菌肽為帶正電荷的多肽（即陽離子型抗菌肽）。

從表3中可以看出，牛源防御素類抗菌肽均可以通過紫外方法進行檢測；對半衰期進行分析，發(fā)現(xiàn)EBD、BNBD2、BNBD8、BNBD11和BNBD12的半衰期相對較長，其他牛源防御素類抗菌肽的半衰期相對較短；對穩(wěn)定性進行分析，發(fā)現(xiàn)TAP、bBD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD7、BNBD8和BNBD9為穩(wěn)定性多肽，其他牛源防御素類抗菌肽為不穩(wěn)定多肽；對脂溶性指數(shù)進行分析，EBD的指數(shù)值最高（＞80），應(yīng)具有較好的耐熱性能，BNBD10的指數(shù)值次之（＞75），而其他牛源防御素類抗菌肽的指數(shù)值稍低，耐熱性能應(yīng)稍差；BNBD12和BNBD13的GRAVY值＞0，表明其為疏水性多肽，而其他牛源防御素類抗菌肽的GRAVY值＜0，表明其為親水性多肽。BNBD7、BNBD9和BNBD10含有E（谷氨酸），僅BNBD1、BNBD2、BNBD3、BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD9含有H（組氨酸），僅TAP、BNBD2、BNBD3、BNBD5和BNBD6不含有L（亮氨酸），僅BNBD4和BNBD5不含有K（賴氨酸），僅 EBD、bBD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD9不含有M（甲硫氨酸），僅TAP、LAP、bBD-1和BNBD10不含有F（苯丙氨酸），僅BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD9不含有S（絲氨酸），僅TAP、LAP、bBD-1、BNBD7、BNBD8和BNBD9不含有W（色氨酸），僅bBD-1、BNBD6和BNBD10含有Y（酪氨酸），僅bBD-1不含有V（纈氨酸）。

表2 牛源防御素的氨基酸數(shù)目、等電點、分子質(zhì)量、帶電氨基酸數(shù)目Table 2 Total number of amino acids,pI,MW and number of charged amino acids of bovien defensins

表4中可以看出，牛源防御素類抗菌肽TAP、LAP、EBD、bBD-1、BNBD1、BNBD2、BNBD3、BNBD4、BNBD5、 BNBD6、 BNBD7、 BNBD8、 BNBD9、 BNBD10、BNBD11、BNBD12和BNBD13分別由13、14、14、15、18、14、15、15、14、15、14、13、14、17、15、15和15種不同的氨基酸殘基構(gòu)成，均含有的氨基酸包括R（精氨酸）、N（天冬酰胺）、C（半胱氨酸）、Q（谷氨酰胺）、G（甘氨酸）、I（異亮氨酸）、P（脯氨酸）和T（酪氨酸），僅TAP、LAP、bBD-1、BNBD1和BNBD10含有A（丙氨酸），僅bBD-1和BNBD1含有D（天冬氨酸），僅 bBD-1、BNBD3、BNBD4、BNBD5、BNBD6、

表 3 牛源防御素的紫外檢測、半衰期、穩(wěn)定性、脂溶性和親水性等信息Table 3 Detection with UV,half life,stability,index of fatty amino acids and hydrophily of bovine defensins

2.2 牛源防御素的二級結(jié)構(gòu) 牛源防御素的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（參數(shù)：視窗寬度為17，相似度閾值為8，狀態(tài)數(shù)目為4）結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出，TAP、LAP、bBD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD4、BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD10由α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，EBD、BNBD1、BNBD5、BNBD11、BNBD12和BNBD13由β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；在17種牛源防御素類抗菌肽中，BNBD10的α螺旋含量最高，BNBD8的β折疊含量最高，LAP的β轉(zhuǎn)角含量最高，EBD的無規(guī)則卷曲含量最高。

2.3 牛源防御素的細胞內(nèi)定位 經(jīng)在線軟件分析，牛源防御素EBD、BNBD2、BNBD4、BNBD8、BNBD11定位于線粒體，而其他防御素可能定位于細胞外。

2.4 牛源防御素的糖基化和磷酸化位點 經(jīng)在線軟件分析，牛源防御素類抗菌肽不存在糖基化。從表6中可以看出，除BNBD7不存在磷酸化位點外，其他16種防御素類抗菌肽存在絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點，但不存在酪氨酸的磷酸化位點；不同的防御素有不同數(shù)目的磷酸化位點，最高的如bBD-1有6個位點的磷酸化，EBD次之，其他的有1～3個磷酸化位點；有的位點可被多種激酶磷酸化，如防御素LAP的第6位點的絲氨酸（S）可被unsp、PKA、DNAPK和ATM等激酶磷酸化。

表 4 牛源防御素的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of bovine defensins

表 5 牛源防御素的二級結(jié)構(gòu)Table 5 Secondary structure of bovine defensins

3 討論

絕大多數(shù)抗菌肽是陽離子型的，其抗菌作用與帶正電荷的氨基酸殘基有關(guān)?？咕牡膸д姾砂被釟埢c帶負電荷的細菌細胞膜相結(jié)合，然后通過不同的作用機制（如桶板模型、地毯模型、蟲孔模型和凝聚模型等）發(fā)揮抑菌或殺菌活性[15-16]。精氨酸、賴氨酸和組氨酸等帶正電荷的氨基酸與抗菌肽的抗菌活性有密切關(guān)系[17-18]。牛源防御素類抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)中存在較多的精氨酸、賴氨酸和組氨酸等堿性氨基酸，使其具有5～10個凈正電荷，這應(yīng)是牛源防御素類抗菌肽發(fā)揮抑菌或殺菌活性的重要基礎(chǔ)。

不同抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)是不同的[12]。例如，抗菌肽LK為α螺旋形[19]，抗菌肽HNP-2為β折疊型[20]?？咕牡亩壗Y(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等構(gòu)成。在牛源防御素類抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最高。而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)有利于抗菌肽的穩(wěn)定性。Lee等[21]認為這種穩(wěn)定性與甘氨酸有關(guān)。牛源防御素類抗菌肽的氨基酸序列中均含有一定比例的甘氨酸。因此，可以認為甘氨酸對牛源防御素類抗菌肽的穩(wěn)定性具有重要作用。

不同抗菌肽的亞細胞定位是不同的[22]。例如，雞內(nèi)源性抗菌肽NK-lysin定位于細胞質(zhì)內(nèi)[23]，雞內(nèi)源性抗菌肽LEAP-2定位于細胞核內(nèi)[24]。經(jīng)分析，牛源防御素類抗菌肽僅少數(shù)定位于線粒體，大多數(shù)定位于細胞外。對于定位于細胞外的牛源防御素類抗菌肽，可能是其前原肽在信號肽的引導(dǎo)下到達細胞外等靶標部位，在某些酶的作用下，產(chǎn)生抗菌肽的成熟肽，從而對細胞外的病原微生物或腫瘤細胞發(fā)揮拮抗作用，或與其受體結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。對于定位于線粒體的牛源防御素類抗菌肽，可能其對線粒體等細胞器具有一定作用，但究竟是何種作用還值得深入探討。

表 6 牛源防御素的的磷酸化位點Table 6 Phosphorylation site of bovine defensins

蛋白磷酸化在細胞分化、凋亡、信號傳遞和免疫等生物學(xué)過程中具有調(diào)節(jié)作用[25]。肌紅蛋白發(fā)生磷酸化修飾后，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性降低[26]，但C/EBPβ蛋白的磷酸化修飾能增強其在3T3-L1前脂肪細胞成脂分化過程中的穩(wěn)定性[27]。經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，除了BNBD7外，牛源防御素類抗菌肽存在不同數(shù)目的絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點?？梢酝茰y，牛源防御素類抗菌肽發(fā)生磷酸化后，其二級結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)改變，但這種改變對牛源防御素類抗菌肽的穩(wěn)定性、抗菌活性等生物學(xué)功能有何具體影響還值得深入研究。