王濤，劉宏祥，齊姣，史小盼，王珍，劉一，閆麗靜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000)

腦卒中作為常見的心腦血管疾病，不僅能夠引起腦組織損傷，還會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)隔重要臟器損傷，其中尤以合并肺部感染最為常見。據(jù)報(bào)道，腦卒中后肺炎的發(fā)生率高達(dá)20%，是與腦卒中死亡有關(guān)的重要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。腦卒中可引起炎癥反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞募集，使肺組織內(nèi)炎癥介質(zhì)過度分泌，最終引起肺組織損傷。因此，改善腦卒中后誘發(fā)肺部炎癥的關(guān)鍵在于控制肺組織炎癥反應(yīng)。然而，目前尚缺乏具有明確療效的靶向藥物。羥基紅花黃色素A(HSYA)具有較強(qiáng)的抗炎作用[2，3]，然而，其對(duì)腦卒中相關(guān)性肺炎(SAP)的作用尚不清楚。2016年8月～2017年5月，本研究采用HSYA對(duì)SAP大鼠進(jìn)行治療，探究其對(duì)大鼠肺組織損傷的改善作用，并初步探討其作用機(jī)制，以期為該病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 50只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠購自北京生命科學(xué)研究所，體質(zhì)量280～320 g，8～10周齡，合格證號(hào)：YXK(京)2015-0002。HSYA純品購自成都康邦生物科技有限公司，純度為89.5%。Janus激酶(JAK2)特異性抑制劑N-芐基-3,4-二羥基亞芐基氰基乙酰胺(AG490)購自美國Sigma-Aldrich公司；正常山羊血清、封閉液購自美國Gibco公司；p-JAK2、磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB) p65抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-18酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、核提取試劑盒、蛋白提取試劑盒購自美國Rche公司。低溫調(diào)整離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；電子天平購自德國Sartorius公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

1.2 SAP模型制備 將SD大鼠隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，其余大鼠制備SAP模型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，采用四動(dòng)脈阻斷法制備急性全腦缺血再灌注致腦-肺綜合征大鼠模型。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將其仰臥固定于固定板上，沿腹正中線切1 cm切口，暴露頸總動(dòng)脈并分離。用棉線環(huán)頸總動(dòng)脈成1 cm線環(huán)后，縫合切口。將大鼠轉(zhuǎn)移至立體定位儀，俯臥固定，于枕骨下沿背正中切1 cm切口，暴露第1頸椎橫突翼小孔后，將注射器針頭搗入小孔，旋轉(zhuǎn)針體至有鮮血溢出，即說明椎動(dòng)脈損毀，維持2～3 min后，止血。椎動(dòng)脈永久阻斷后縫合切口。假手術(shù)組僅暴露第1頸椎和頸總動(dòng)脈，不阻斷血管。術(shù)后即刻腹腔注射青霉素8萬U，1次/d，持續(xù)3 d。模型廢棄標(biāo)準(zhǔn)：大鼠四肢上舉，翻正反射、痛覺反應(yīng)消失，瞳孔散大，眼球灰白色，在灌注期內(nèi)意識(shí)未恢復(fù)；在缺血期死亡或昏睡，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)抽搐。造模48 h內(nèi)觀察大鼠進(jìn)食減少、飲水增多、毛色灰暗、背部弓起、耳緣靜脈突起加粗，并伴有眼球變濁暗淡等癥狀，同時(shí)肺部聽診可聞及雜音，且呼吸急促，則判定為造模成功。將大鼠仰臥固定，重新打開頸部切口，以動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷30 min后松開動(dòng)脈夾，再灌注3 h。

1.3 HSYA治療方法及標(biāo)本采集 將造模成功的SAP模型大鼠隨機(jī)分為4組各10只：SAP組、AG490組、低劑量HSYA組(L-HSYA組)和高劑量HSYA組(H-HSYA組)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5，6]對(duì)大鼠進(jìn)行藥物治療。AG490組經(jīng)尾靜脈注射AG490 5 mg/kg，L-HSYA組和H-HSYA組分別經(jīng)尾靜脈注射低劑量(8 kg/mg)、高劑量(16 kg/mg)HSYA，假手術(shù)組、SAP組經(jīng)尾靜脈注射等劑量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后6 h，各組經(jīng)腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉，迅速于左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗；切除右肺上葉組織，將其洗滌后固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；取右肺中葉以測算肺組織濕/干重量比(W/D)；切除右肺下葉組織，于-80 ℃凍存?zhèn)錂z。

1.4 肺組織病理學(xué)觀察 將切除的右肺上葉組織固定于4%多聚甲醛中24 h，石蠟包埋，制備5 μm厚切片。脫蠟后，將連續(xù)切片用HE染色后，于顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以400倍視野收集圖像。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，采用半定量評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估肺組織病理學(xué)嚴(yán)重程度，包括肺泡充血、出血,白細(xì)胞浸潤,肺間質(zhì)水腫,肺泡壁厚度等，每項(xiàng)評(píng)分0～4分，共20分。分值越高表示肺組織病理變化越嚴(yán)重。

1.5 肺組織W/D值測算 將切除的右肺中葉進(jìn)行測量，記錄W值；之后將右肺中葉置于110 ℃烤箱烘干，24 h后測量，記錄D值。

1.6 肺組織中髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 右肺下葉組織解凍后用50 mmol/L Tris-HCL 1 mL勻漿，與鈉緩沖液混勻后離心。收集沉淀重懸于磷酸鉀緩沖液中，根據(jù)說明書，采用MPO檢測試劑盒檢測MPO活性。在37 ℃反應(yīng)體系中1 g肺組織分解1 μmol過氧化氫記作1個(gè)活力單位(U/g)。

1.7 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細(xì)胞因子檢測 大鼠麻醉后，以血管夾夾閉右肺門后，于左肺用冷PCS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，共灌洗5次，收集BALF，于4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用TNF-α、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒，根據(jù)說明書檢測BALF中各炎性細(xì)胞因子水平。

1.8 肺組織核提取物中NF-κB結(jié)合活性檢測 采用核提取試劑盒，根據(jù)說明書從肺組織中提取核蛋白。使用TransAM NF-κB試劑盒測量 p65 DNA結(jié)合活性。

1.9 肺組織核提取物中NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。使用RIPA裂解緩沖液，根據(jù)說明書從肺組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。4 ℃下將膜與p-JAK2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)的一抗和β-actin(1∶5 000)孵育過夜。洗滌后與辣根過氧化物酶綴合的二抗一起溫育。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影后，用Quantity One軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理變化比較 SAP組可觀察到微小肺血管和肺泡隔膜毛細(xì)血管的擴(kuò)張，肺胞腔變窄、肺泡壁增厚，部分肺泡受損，肺泡隔變寬，肺胞及肺間質(zhì)組織中可見明顯的白細(xì)胞浸潤，并伴有充血、出血和肺間質(zhì)水腫。與SAP組比較，AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺組織病理變化均改善。假手術(shù)組、SAP組、AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺損傷評(píng)分分別為(2.62±0.76)、(15.33±2.26)、(4.34±1.15)、(9.68±2.13)、(5.01±1.36)分。與假手術(shù)組比較，SAP組肺損傷評(píng)分高(P<0.05)；與SAP組比較，AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組肺損傷評(píng)分低(P均<0.05)；與AG490組、H-HSYA組比較，L-HSYA組肺損傷評(píng)分高(P均<0.05)；AG490組與H-HSYA組肺損傷評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠W/D值比較 假手術(shù)組、SAP組、AG490組、L-HSYA組及H-HSYA組W/D值分別為4.13±1.10、8.92±1.87、5.65±0.98、7.08±1.24、6.10±1.17。與假手術(shù)組比較，SAP組肺組織W/D值高(P<0.05)；與SAP組比較，AG490組、L-HSYA組和H-HSYA組肺組織W/D值低(P均<0.05)；與AG490組、H-HSYA組比較，L-HSYA組肺組織W/D值高(P均<0.05)；AG490組與H-HSYA組肺組織W/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組MPO活性、炎癥因子水平比較 見表1。

表1 大鼠BALF中炎癥因子水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05；與AG490組比較，&P<0.05；與L-HSYA組比較，△P<0.05。

2.4 各組肺組織核提取物中NF-κB活性比較 見表2。

表2 各組肺組織核提取物中NF-κB活性比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05；與AG490組比較，&P<0.05；與L-HSYA組比較，△P<0.05。

2.5 各組肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05；與AG490組比較，&P<0.05；與L-HSYA組比較，△P<0.05。

3 討論

HSYA是從傳統(tǒng)中藥紅花中提取的黃色色素的主要活性化學(xué)成分，屬于一種新型的查耳酮糖苷。HSYA具有顯著的心腦血管保護(hù)作用，且與其抗氧化損傷和抗炎作用有關(guān)[8，9]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA治療能夠改善SAP大鼠肺組織病理學(xué)損傷和肺水腫，提示HSYA能夠減輕SAP大鼠肺組織炎癥反應(yīng)。然而，HSYA對(duì)肺組織炎癥性損傷改善的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究采用改良四動(dòng)脈阻斷法制備全腦缺血再灌注致腦-肺綜合征模型，發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注損傷大鼠肺組織表現(xiàn)出明顯的病理學(xué)改變，包括白細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)水腫、肺泡充血、肺泡腔變窄、肺泡壁增厚等；大鼠肺W/D值升高，說明發(fā)生嚴(yán)重肺水腫。該模型大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重肺組織炎癥損傷和明確的肺組織病理改變。因此，改善腦卒中后誘發(fā)的肺損傷關(guān)鍵在于控制肺組織炎癥反應(yīng)。

肺泡巨噬細(xì)胞是肺組織中最豐富的先天性免疫細(xì)胞，通過產(chǎn)生過量的TNF-α、IL-1β、IL-18等促炎性細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)[10]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，IL-18和IL-1β中合抗體的應(yīng)用能夠減輕急性肺損傷動(dòng)物模型中的肺損傷[11]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)能夠進(jìn)一步促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的浸潤至損傷肺組織中，加重肺組織炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[12]。中性粒細(xì)胞浸潤是與肺炎癥性損傷有關(guān)的關(guān)鍵因素[13]。MPO是中性粒細(xì)胞浸潤的標(biāo)志物。研究證實(shí)，中性粒細(xì)胞的消除能夠顯著降低動(dòng)物模型中的肺損傷嚴(yán)重程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平升高，且肺組織MPO活性增加，進(jìn)一步證實(shí)SAP大鼠肺組織炎性損傷。研究表明，HSYA能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HSYA治療后，肺BALF中炎癥細(xì)胞因子水平均顯著降低，且MPO活性降低，提示HSYA可能通過減少肺組織中炎癥細(xì)胞因子分泌，抑制肺組織中性粒細(xì)胞浸潤，從而減輕肺組織炎癥反應(yīng)，緩解肺組織損傷。

NF-κB是能特異性結(jié)合免疫球蛋白κ輕鏈基因10 bp堿基序列，并促進(jìn)κ基因表達(dá)的核蛋白。NF-κB是促炎性轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)過程中引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)外多種刺激信號(hào)能夠激活NF-κB，使活化的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，與誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)序列中的特定κB位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)編碼炎性細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞和組織損傷，參與多種疾病的病理生理過程。研究表明，NF-κB的高表達(dá)能夠通過誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)而參與炎癥性肺損傷的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAP組肺組織中NF-κB活性增加，且NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，提示NF-κB的活化與SAP大鼠肺組織炎癥損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能夠通過抑制NF-κB活化減輕炎癥反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能明顯降低NF-κB活性及蛋白表達(dá)水平。提示，HSYA可能通過抑制NF-κB活化，抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而改善肺組織損傷。

JAK/STAT信號(hào)通路是一種具有干擾素樣作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。JAK家族包括四個(gè)激酶成員，JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2。AG490是特異的JAK酪氨酸磷酸化抑制劑，能夠有效阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制STAT的激活[18]。STAT是JAK的下游底物，是細(xì)胞質(zhì)中的一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的特定DNA序列結(jié)合。JAK/STAT信號(hào)通路能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-18等多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞因子直接負(fù)責(zé)將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而參與調(diào)節(jié)多種病理生理過程(免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、炎癥和癌癥等)。已有研究證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路激活在肺組織損傷中發(fā)揮重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠肺組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)升高，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活參與肺炎癥性損傷。而HSYA能夠抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活化。過往研究證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路激活能夠促進(jìn)NF-κB活化，從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3特異性抑制劑AG490能夠抑制NF-κB活化和p65的核易位，與過往研究一致。經(jīng)HSYA治療后，SAP大鼠肺組織NF-κB的活化被抑制，與AG490作用效果一致。結(jié)合過往研究推測，HSYA通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活，進(jìn)一步抑制NF-κB活化，參與調(diào)控肺組織炎癥反應(yīng)。

肺組織中JAK/STAT信號(hào)通路能夠被多種因素激活，包括炎癥、缺血、缺氧等。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子通過使STAT3磷酸化，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，加重肺損傷[20]。徐志紅等[21]發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠肺組織內(nèi)p-JAK2、p-STAT3表達(dá)上調(diào)與IL-1β、TNF-α水平上調(diào)一致，證實(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，從而進(jìn)一步加重肺損傷。結(jié)合過往研究推測，HSYA能夠抑制肺組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路激活，減少炎癥細(xì)胞因子分泌，同時(shí)抑制NF-κB活化及核易位，從而進(jìn)一步抑制炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制肺組織中炎性細(xì)胞浸潤，緩解肺組織損傷。

綜上所述，HSYA對(duì)SAP大鼠的炎癥性肺損傷具有改善作用，這可能與其抑制肺組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路激活有關(guān)。然而，本研究中HSYA僅能部分緩解肺組織損傷及炎癥反應(yīng)，而非完全逆轉(zhuǎn)SAP大鼠的肺損傷，這可能與藥物劑量有關(guān)，也有可能是由于SAP中的肺組織損傷不僅與炎癥有關(guān)，還與其他因素有關(guān)。后續(xù)研究還需深入探討，以期為疾病治療提供更充分的依據(jù)。