黃浪，徐策，許光宇

(1海南省人民醫(yī)院，海口570311；2川北醫(yī)學院；3開封大學)

研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與心臟發(fā)育或心臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。當發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，細胞內(nèi)細胞器包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞核中的多種相互關(guān)聯(lián)的信號傳導通路被連續(xù)激活，該現(xiàn)象即為未折疊蛋白反應(UPR)。其中分子伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及3個感受器蛋白肌醇酶1(IRE1)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)及活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)共同構(gòu)成并參與了UPR的整個過程，以上指標也反映了機體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)[2，3]。因此，尋找有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的藥物，對于冠心病的治療具有重要意義[4]。黃芩苷是從中藥黃芩根莖中分離純化的黃酮類單體化合物，其具有抗氧化和抗細胞凋亡等多種生物學功能，在改善心肌缺血及提高心肌功能方面有一定作用[5]。本研究于2017年1～12月探討黃芩苷對冠心病大鼠缺血再灌注損傷的治療作用及機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量(200±50)g，1月齡，由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供。黃芩苷(固體粉劑，純度99.8%，批號2015034，西安昊軒生物科技公司)，小動物麻醉機(E-Z美國Systems公司)，兔抗人GRP78、IREI、PERK和ATF6單抗(CST公司)，qRT-PCR檢測試劑盒(Takara公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(武漢博士德公司)，TRIzol試劑(Invitrogen公司)，蛋白提取試劑盒、ECL增強化學發(fā)光試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo公司)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems公司)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies公司)，qSYBR-Green-containing PCR試劑盒(Qiagen公司)，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡Olympus IX7(Olympus，UIS2光學成像系統(tǒng)，Image-Pro Plus7.0成像系統(tǒng))，Multiskan MK3酶標儀(Thermo公司，型號413MBY042078)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(德國羅氏公司)，IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(tǒng)(美國BioRad公司)。

1.2 冠心病模型構(gòu)建 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，將其隨機均分為對照組、模型組、10 mg/kg黃芩苷組、25 mg/kg黃芩苷組和50 mg/kg黃芩苷組，各5只。建立冠心病大鼠模型，方法：冠心病與黃芩苷組先給予維生素D 70萬U/kg連續(xù)灌胃5 d后給予高脂飼料飼養(yǎng)，每100 g飼料中含膽固醇3 g、白糖5 g、豬油20 g、維生素D 1 g、蛋黃粉2 g、丙基硫氧嘧啶0.2 g、基礎(chǔ)飼料69 g，飼養(yǎng)16 周。對照組先給予等體積生理鹽水灌胃5 d后給予普通飼料飼養(yǎng)，每100 g飼料中含米糠9 g、玉米粉50 g、骨粉3 g、黃豆粉30 g、維生素1.3 g、礦物質(zhì)6.7 g，飼養(yǎng)16周。腹腔內(nèi)注射25%烏拉坦3 mL/kg麻醉，30 min后腹腔內(nèi)注射垂體后葉素30 U/kg，當心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)T波低平或倒置，ST段下移，表明冠心病大鼠造模成功。模型組與黃芩苷干預組大鼠均造模成功。

1.3 藥物干預及心肌缺血模型構(gòu)建 成功建模后，10、25、50 mg/kg黃芩苷組分別給予10、25、50 mg/kg黃芩苷灌胃，模型組、對照組給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)2周，期間各組均常規(guī)喂養(yǎng)。灌胃結(jié)束前晚8點撤走食槽，各組均禁飲食12 h，腹腔內(nèi)注射25%烏拉坦3 mL/kg麻醉，30 min后除對照組外其余各組均腹腔內(nèi)注射垂體后葉素30 U/kg建立冠心病心肌缺血模型，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 大鼠心功能檢測 各組背部固定，記錄大鼠心功能相關(guān)指標。將針灸針刺入大鼠四肢皮下，導聯(lián)線一端接于生物信號采集器，一端黑色、紅色、黃色夾子夾在針灸針上，大鼠安靜時記錄心電圖，持續(xù)時間1 min。觀測并記錄各組大鼠缺血30 min的心電圖T波變化，然后經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管到大鼠的左心室，連接壓力傳感器和生物信號處理系統(tǒng)，記錄左室舒張壓、收縮壓、最大收縮期內(nèi)的壓力變化速率(+dp/dtmax)、最大舒張末期的壓力變化速率(-dp/dtmax)。人工呼吸下開胸結(jié)扎冠狀動脈左旋支7 min，隨后再灌注120 min時T波變化，觀測并記錄各組大鼠的心電圖，同時監(jiān)測左室舒張壓、收縮壓、+dp/dtmax、-dp/dtmax。

1.5 大鼠心肌梗死面積百分比測算 采用硝基四氮唑藍染色法。處死大鼠后獲取心肌組織，清潔之后的心臟于-20 ℃冷凍1 h后，將其切成2 mm切片，放在1%的TTC磷酸緩沖液內(nèi)，室溫下避光孵育20 min后停止染色，將切片置于10%甲醛溶液中固定，第2天可觀察到非梗死區(qū)為深紅色著色，梗死區(qū)為灰白色著色，經(jīng)數(shù)碼相機拍照采集數(shù)據(jù)，再經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)采集并計算左心室梗死區(qū)的實際面積百分比。

1.6 大鼠心肌細胞凋亡率測算 用缺口末端標記法。在顯微鏡下可觀察到凋亡細胞核為棕褐色著色，圖像采集時每張切片均需隨機選擇并記錄至少5個高倍鏡下的視野，統(tǒng)計其中總細胞核數(shù)量大于200的數(shù)據(jù)，計算細胞的凋亡數(shù)量和總數(shù)量的比值。

1.7 大鼠心肌組織中GRP78、IREI、PERK和ATF6蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取大鼠心臟組織200 mg，將其磨碎后加進預冷蛋白質(zhì)的抽提試劑，將其放置0.5 h后給予14 000 r/min離心15 min，再提取上清液實施蛋白檢測。電泳后取1 μg的蛋白給予變性冷卻，依次加樣和電泳以及轉(zhuǎn)膜，再添加封閉液，在室溫下封閉1 h，添加稀釋1∶1 000的兔抗人GRP78、IREI、PERK、ATF6和GAPDH一抗(CAT，美國)進行孵育，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶100 000的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X線片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶圖片。以Quantity One軟件分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。每組設(shè)置3個復孔。

1.8 大鼠血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。心肌缺血模型構(gòu)建成功次日清晨用吸入式異氟烷麻醉大鼠，用1 mL注射器經(jīng)大鼠上腔靜脈取血，在3 000 r/min下離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待檢。TRIzol法提取血清中的mRNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄聚酶鏈反應試劑盒的說明書進行操作。GRP78、IREI、PERK和ATF6的引物由Invitrogen公司合成，GAPDH為內(nèi)參,反應體系為20 μL。用2-ΔΔCT法計算GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA的相對表達量。每個樣本設(shè)置3個復孔。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標比較 與對照組比較，模型組缺血30 min波形變化、缺血再灌注120 min T波變化和左室舒張壓高(P均<0.05)，左室收縮壓、+dp/dtmax和-dp/dtmax均低(P均<0.05)；與模型組比較，10、25、50 mg/kg黃芩苷組缺血30 min波形變化、缺血再灌注120 min T波變化和左室舒張壓低(P均<0.05)，左室收縮壓、+dp/dtmax和-dp/dtmax均高(P均<0.05)，且具有劑量依賴性(P均<0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標比較

2.2 各組心肌梗死面積百分比、心肌細胞凋亡率比較 與對照組比較，模型組心肌梗死面積百分比、心肌細胞凋亡率高(P均<0.05)；與模型組比較，10、25、50 mg/kg黃芩苷組心肌梗死面積百分比、細胞凋亡率均低(P均<0.05)，且具有劑量依賴性(P均<0.05)。見表2。

表2 各組心肌梗死面積百分比、心肌細胞凋亡率比較

2.3 各組心肌組織中GRP78、IRE1、PERK、ATF6蛋白表達比較 與對照組比較，模型組心肌組織中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白相對表達量高(P均<0.05)；與模型組比較，10、25、50 mg/kg黃芩苷組心肌組織中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白相對表達量低(P均<0.05)，且具有劑量依賴性(P均<0.05)。見表3。

表3 各組心肌組織中GRP78、IRE1、PERK、ATF6蛋白表達比較

2.4 各組血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA表達比較 與對照組比較，模型組血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6 mRNA相對表達量高(P均<0.05)；與模型組比較，10、25、50 mg/kg黃芩苷組血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6 mRNA相對表達量低(P均<0.05)，且具有劑量依賴性(P均<0.05)。見表4。

表4 各組血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA表達比較

3 討論

黃芩苷是從中藥黃芩的根莖中分離純化得到的一種黃酮類單體化合物，黃芩苷具有多種生物活性和功效，如抗氧化、抗凋亡和抗過敏作用、增強機體免疫力的作用、抑菌作用等[6,7]。除此之外，研究顯示，黃芩苷可在多種心血管疾病中發(fā)揮良好的治療作用，如黃芩苷對鐵超載小鼠的肝、腎和心臟組織的氧化損傷均有不同程度的改善作用[8]；黃芩苷可降低嚴重急性胰腺炎大鼠的炎癥指標、減少心肌細胞的凋亡，對損傷大鼠的心臟有保護作用[9]。但其具體作用機制目前尚不明確，特別是關(guān)于黃芩苷在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的調(diào)節(jié)作用，迄今為止國內(nèi)文獻尚無相關(guān)報道。

各種損傷性因素均可激活機體組織和細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制，從而導致動脈粥樣硬化、缺血性心臟病(冠心病)、缺血再灌注心肌損傷和心肌肥大等多種心臟類疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多種蛋白質(zhì)及糖和脂合成的細胞器，其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)易受各種理化因素的影響，從而直接影響蛋白質(zhì)的合成和表達，影響細胞的生存狀態(tài)。若細胞發(fā)生UPR，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，進一步誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，導致細胞凋亡，最終直接導致細胞死亡。另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還可通過介導多種信號通路直接影響分子伴侶蛋白GRP78及其3個感受器蛋白IRE1、PERK和ATF6的表達，使其表達上調(diào)，從而誘導細胞凋亡[10～12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織和血清中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表達均高于對照組，心肌梗死面積百分比和細胞凋亡率高于對照組。說明模型構(gòu)建成功。冠心病心肌缺血再灌注損傷是影響冠心病患者預后的一個重要因素。再灌注過程中會產(chǎn)生大量氧自由基，使心肌細胞內(nèi)鈣超載，直接造成心臟再灌注損傷[13]。研究顯示，心肌缺血再灌注過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應激反應，更進一步促進冠心病的進展；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打亂，激活其關(guān)聯(lián)的生存或凋亡相關(guān)通路，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子的表達上調(diào)，心肌細胞凋亡增加，進一步加重心肌缺血再灌注損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組缺血30 min的波形變化、缺血再灌注120 min T波變化和左室舒張壓均增加，大鼠左室收縮壓、+dp/dtmax和-dp/dtmax均降低；而不同劑量的黃芩苷可逆轉(zhuǎn)上述指標的變化趨勢，且黃芩苷的逆轉(zhuǎn)能力呈劑量依賴性。這提示黃芩苷針對冠心病大鼠的缺血再灌注損傷具有較好的治療作用。另外不同劑量的黃芩苷使模型組大鼠的心肌組織和血清中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表達下調(diào)，可見黃芩苷可抑制冠心病大鼠中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子的表達；且該作用呈劑量依賴性，當黃芩苷劑量為10～50 mg/kg時，濃度越高，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子表達的作用就越強。上述結(jié)果與已有研究[15]類似。

綜上所述，黃芩苷可減少冠心病大鼠心肌梗死面積，降低心肌細胞凋亡率。原因可能為黃芩苷可調(diào)節(jié)GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表達，進而改善了大鼠冠心病癥狀，并對心肌細胞及心臟功能有一定的保護作用。