曹 姣

(廣東第二師范學(xué)院 體育學(xué)院，廣東 廣州 510303)

長(zhǎng)期的高血壓可引起心臟發(fā)生病理性心肌肥大，出現(xiàn)心肌纖維化，包括間質(zhì)和心肌內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管周圍纖維化[1]。心肌纖維化可通過(guò)加劇心肌和脈管的生物力學(xué)硬度，干擾生物電耦合，損害心臟的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心衰，成為導(dǎo)致高血壓患者死亡的重要原因。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)/Smad3為細(xì)胞內(nèi)典型的纖維化通路。Yu YS等研究顯示，20周齡SHR大鼠心肌AngII水平、NOX4表達(dá)均增加[2]。Chen M等研究顯示，TGF-β1相關(guān)的信號(hào)通路參與16周齡自發(fā)性高血壓大鼠心肌間質(zhì)纖維化[3]。在TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，心肌AT1受體(AngII的受體)阻滯劑不足以抑制肥大反應(yīng)，而TGF-β1敲除大鼠抵抗了血管緊張素II(angiotensin II，AngII)介導(dǎo)的心肌肥大[4]，以上提示AngII可能通過(guò)TGF-β1介導(dǎo)心肌肥大和纖維化[5]。然而其所介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路是如何參與自發(fā)性高血壓心肌纖維化過(guò)程？尚不清楚。有氧運(yùn)動(dòng)作為一種非藥理學(xué)手段來(lái)改善高血壓心肌間質(zhì)纖維化，TGF-β1/smad3通路是否在其中發(fā)揮作用？具體的作用機(jī)制如何? 尚未被研究。本研究選取自發(fā)性高血壓大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其實(shí)施游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討高血壓心肌纖維化改善過(guò)程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，以期探尋運(yùn)動(dòng)保護(hù)高血壓新的作用靶點(diǎn)，為高血壓心肌間質(zhì)纖維化運(yùn)動(dòng)療法的開展提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取4月齡SPF級(jí)雄性SHR大鼠20只和WKY組大鼠8只，體重為250～300g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃，適應(yīng)期自由飲水進(jìn)食。飼料選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物混合飼料的普通飼料，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 大鼠實(shí)驗(yàn)分組

所有大鼠于15周齡購(gòu)進(jìn)，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為三組，分別為：WKY組(正常對(duì)照組)(8只)；SHR組大鼠分成模型組(10只)和SHR+運(yùn)動(dòng)組(10只)。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期12周不負(fù)重游泳訓(xùn)練(有氧運(yùn)動(dòng))，第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練。第1天運(yùn)動(dòng)時(shí)間為10 min，以后每天遞增10 min逐步增加到60 min/d，從第2周開始維持此運(yùn)動(dòng)時(shí)間至12周結(jié)束[6]，水溫控制為30℃。

1.4 取材與保存

大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量：0.35～0.40 ml/kg bw)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置、處理，用于血液學(xué)指標(biāo)測(cè)試。取大鼠部分心尖組織置于10%甲醛溶液固定24～48 h，用于制備心肌組織病理切片；另取部分心尖組織用錫紙包裹迅速置于液氮凍存，并最后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱待測(cè)心肌中各生化指標(biāo)。

1.5 測(cè)試指標(biāo)及檢測(cè)方法

Olymplus顯微鏡每張切片隨機(jī)選出6個(gè)視野，在400倍光鏡視野下獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析，測(cè)量每個(gè)視野中藍(lán)色膠原纖維染色的面積，計(jì)算膠原面積與心肌組織總面積的比值(%)，取其平均值作為每只大鼠的膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF%)。

大鼠血壓選用ALC-NIBP無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)定；大鼠心肌間質(zhì)纖維化形態(tài)學(xué)采用Masson染色；col I、col III表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法；血漿和心肌AngII采用放免法，心肌Smad3mRNA采用QRT-PCR法，心肌NOX2、TGF-β1、HSP90蛋白采用Western-blot方法。

1.5.1 血壓測(cè)定

選用ALC-NIBP無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠安靜清醒狀態(tài)的尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。于實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)期間的每周測(cè)量，每只大鼠間隔1min測(cè)量共5次，取其中結(jié)果相差控制在5～10mmHg內(nèi)的測(cè)定次數(shù)，從中取3次，求平均值作為大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。

1.5.2 Masson染色測(cè)試大鼠心肌間質(zhì)纖維化形態(tài)學(xué)

常規(guī)脫水包埋；切片脫蠟后于0.5%碘酒中作用10min；水洗，5%的硫代硫酸鈉作用5min；流水沖洗10min，weigert氏鐵蘇木素染5～10min；水洗，1%硫酸酒精分化；水洗，麗春紅酸性品紅液染5～10min；水洗，1%磷酸水溶液處理約5min；苯胺藍(lán)液或亮綠液復(fù)染5min；冰醋酸處理1min；95%酒精脫水多次；無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，中興樹膠封固。

1.5.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)試col I、col III表達(dá)

組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片；脫蠟，水化；PBS沖洗3次×5min；3%H2O2封閉，室溫10min；抗原微波修復(fù)；10%山羊血清(0.1 Mpbs 配制，加Triton-100工作液濃度0.1%)孵育，室溫20min～1h；滴加一抗(0.1 Mpbs 配制，加Triton-100工作液濃度0.1% )，4℃過(guò)夜；室溫負(fù)溫1h，回收一抗；加二抗，室溫孵育3h，回收二抗；DAB顯色；PBS沖洗；蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗10～15min；脫水，透明，封片，鏡檢。

1.5.4 放免法測(cè)試血漿和心肌AngII

血漿和心肌AngII采用放免法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.5 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR(QRT-PCR)法測(cè)定Smad3基因表達(dá)

取肝臟組織50～100 mg組織，采用經(jīng)典方法經(jīng)Trizol裂解液、氯仿、異丙醇提取總RNA。準(zhǔn)備1.5mL EP管，加入約4μg模板RNA，1μL Oligo(dT)18引物，1μL (10 mmol)dNTP mix， DEPC水定容至12μL，離心；65℃水浴5min后離心，加入4μL 5×First-Strand Buffer、1 μL RibolockTMRibonuclease Inhibitor、2 μL0.1MDTT；離心，37℃水浴2min，加入1μL (200U/μL)ReverAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(總反應(yīng)體積20 μL)； 37℃水浴50 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；70℃水浴15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；立即進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系組成為0.5μL cDNA模板、10μL GoTaq?qPCR Master Mix (2×)、0.4μL引物-1(10uM)、0.4μL引物-2(10uM)、0.2μL CXR、

8.5μL ddH2O，總體積20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min；變性95℃ 15s、退火60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)；Melt。引物序列見表1。

表1 引物序列一覽

1.5.6 心肌NOX2、TGF-β1、HSP90蛋白采用Western-blot法

稱取100mg組織，加入1 mL RIPA和10μL 100 mM 的PMSF、10 μL磷酸酶抑制劑，勻漿；4℃12000 g/min高速離心30 min；轉(zhuǎn)移上清；BCA試劑盒總蛋白定量；加電泳上樣緩沖液；沸水浴5 min，12000 r/min離心3min，上樣；電泳；轉(zhuǎn)膜；取膜，洗滌，室溫封閉30 min，4 ℃過(guò)夜；加已稀釋好的兔抗體NOX2、TGF-β1、HSP90 (1: 200) (稀釋液含2%的BSA)，4℃過(guò)夜；TBST洗膜；加5 mL 1：5000稀釋(稀釋液含2%的脫脂奶粉)的羊抗兔二抗，37 ℃反應(yīng)1 h；洗膜；加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑；浸透晃洗，水洗，自然晾干。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 和Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示，顯著性水平為P<0.05，非常顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓的變化

表2干預(yù)期間各組大鼠收縮壓(SBP)的變化

組別干預(yù)前第4周第8周第12周C組136.99±0.58137.54±0.88136.73±0.82139.92±0.81H組174.59±0.67△△182.60±0.49△△200.24±1.45△△208.75±1.29△△EH組173.55±1.25△△178.21±1.46△△188.58±0.94△△$196.85±1.53△△$$

注：△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，￥￥P < 0.01，與H組比較。

如表2所示，與C組對(duì)應(yīng)周比較，H組大鼠收縮壓各對(duì)應(yīng)周均非常顯著性升高(P < 0.01)，與H組對(duì)應(yīng)周比較，EH組大鼠第8周收縮壓顯著性降低(P < 0.05)，而第12周非常顯著性降低(P < 0.01)。

2.2 各組大鼠心肌間質(zhì)纖維化形態(tài)學(xué)的變化

2.2.1 各組大鼠心肌CVF%、col I、col III蛋白表達(dá)的變化

圖1 各組大鼠心肌Masson染色結(jié)果(Masson，×400)

圖2 各組大鼠心肌col I免疫組化染色結(jié)果(DAB顯色，×400)

圖3 各組大鼠心肌col III免疫組化染色結(jié)果(DAB顯色，×400)

注：△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較。圖4 各組大鼠心肌中CVF%、col I、col III蛋白表達(dá)的變化

如圖4所示，與C組比較，H組大鼠心肌CVF%、col I、col III蛋白表達(dá)均非常顯著性增加(P<0.01)，與H組比較，EH組心肌CVF%、col I、col III蛋白表達(dá)均顯著性降低(P < 0.05)。

2.3 各組大鼠血漿和心肌AngII含量的變化

表3 各組大鼠血漿和心肌AngII含量的變化(pg/ml)

注：△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較

如表3所示，與C組比較，H組大鼠血漿AngII和心肌AngII含量均非常顯著性增加(P < 0.01)，與H組比較，EH組血漿AngII和心肌AngII含量均顯著性降低(P < 0.05)。

2.4 各組大鼠心肌NOX2蛋白表達(dá)的變化

圖5 各組大鼠心肌NOX2蛋白表達(dá)的變化(NOX2 /GAPDH)注：△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較。

如圖5所示，與C組比較，H組大鼠心肌NOX2蛋白表達(dá)非常顯著性增加(P < 0.01)，與H組比較，EH組NOX2蛋白表達(dá)顯著性降低(P < 0.05)。

2.5 各組大鼠心肌TGF-β1、Smad3表達(dá)的變化

2.5.1 各組大鼠心肌TGF-β1表達(dá)的變化

圖6 各組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達(dá)的變化(TGF-β1 /GAPDH)注：△P < 0.05，△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較。

如圖6所示，與C組比較，H組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達(dá)非常顯著性增加(P < 0.01)；與H組比較，EH組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著性降低(P < 0.05)。

2.5.2 各組大鼠心肌Smad3基因表達(dá)的變化

圖7 各組大鼠心肌Smad3基因PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線

圖7為各組大鼠心肌中Smad3基因PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線，由圖7可見，心肌組織以Smad3 cDNA為模版擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物峰值到來(lái)之前的曲線平滑、無(wú)雜峰，顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性強(qiáng)，且其熔解曲線峰值集中、熔解溫度均一、峰形銳利。對(duì)Smad3的QRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷和分析，其結(jié)果如表4所示。

表4 各組大鼠Smad3 mRNA表達(dá)

注：△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較。

由表4可知，與C組比較，H組大鼠心肌Smad3基因表達(dá)非常顯著性增加(P< 0.01)，與H組比較， EH組Smad3基因表達(dá)均顯著性降低(P < 0.05)。

2.6 各組大鼠心肌HSP90蛋白表達(dá)的變化

如圖8所示，與C組比較，H組大鼠心肌HSP90蛋白表達(dá)顯著性增加(P < 0.05)，與H組比較，EH組大鼠心肌HSP90蛋白表達(dá)顯著性升高(P<0.05)。

3 分析與討論

3.1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓、心肌間質(zhì)纖維化及I、III型膠原的影響

高血壓的長(zhǎng)期高壓力負(fù)荷狀態(tài)可使心肌產(chǎn)生過(guò)度的纖維化，包括間質(zhì)和心肌內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管周圍纖維化，損害心臟功能[7]。心肌膠原蛋白主要包括膠原I型(80%)和III型(20%)[1]。心肌纖維化是膠原合成和降解失衡的結(jié)果，以過(guò)量的纖維狀膠原沉積以及沉積膠原比例失常(I/III型膠原比值增加)為特征。既往研究顯示，24周齡SHR大鼠心肌中過(guò)量膠原沉積和col I、colIII顯著增加，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo preteinases，MMP9)活性減少，而激活蛋白1(activator protein -1，AP-1)和核轉(zhuǎn)錄因子B(nuclear factor kappa B，NF-κB)激活，左心室射血分?jǐn)?shù)降低[8]。Pei Z等研究顯示，成年雄性SHR大鼠心肌ANP、β肌球蛋白重鏈(β myosin heavy chain,β-MHC)、膠原含量(col I和col III)、心肌纖維化增加[6]。本研究結(jié)果顯示，與正常血壓對(duì)照組(C組)比較，SHR模型組大鼠(H組)心肌中膠原容積分?jǐn)?shù)、col I、col III非常顯著性高于C組(P < 0.01)，與前人研究相一致[8]。

圖8 各組大鼠心肌組織HSP90蛋白表達(dá)的變化 (HSP90 /GAPDH)

注：△P < 0.05，△△P < 0.01，與C組比較；￥P < 0.05，與H組比較。

Hyo-Bum Kwak等研究顯示，12周有氧運(yùn)動(dòng)能下調(diào)MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14，增加抗MMP的因子金屬蛋白酶組織抑制劑1水平，顯著改善衰老大鼠心肌纖維化[9]。Thomas, D P等研究顯示，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能減少青中年大鼠心肌col ImRNA水平，對(duì)老年大鼠col I mRNA水平影響不明顯[10]。而對(duì)高血壓大鼠的研究中，僅尹懿等研究顯示，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能顯著降低16月齡雄性SHR大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、I型、III型膠原蛋白表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)選取游泳運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行干預(yù)，12周干預(yù)后，與SHR模型組(H組)比較，運(yùn)動(dòng)組(EH組)大鼠收縮壓、心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、col I和col III蛋白表達(dá)值均減少(P < 0.05或P<0.01)，提示12周游泳運(yùn)動(dòng)能顯著降低16周齡SHR大鼠血壓、心肌間質(zhì)纖維化。

3.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠AngII/TGF-β1/Smad3的影響

SHR大鼠心肌纖維化可能與多種原因有關(guān)，包括交感神經(jīng)過(guò)度激活[12]、促炎癥細(xì)胞因子如IL-1β促炎癥機(jī)制[13]以及腎素-血管緊張素(AngII)-醛固酮系統(tǒng)(RAS)[14]、TGFβ1途徑[15]等。AngII是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)一個(gè)組分，在維持心血管穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，與進(jìn)展性心功能障礙、不良重塑和心衰有關(guān)。然而其在高血壓心肌纖維化中起作用的具體機(jī)制是怎樣？運(yùn)動(dòng)能有效改善高血壓心肌間質(zhì)纖維化，是否通過(guò)RAS途徑實(shí)現(xiàn)？其作用機(jī)制是什么？目前研究尚不明確。

TGF-β是潛在的促纖維化因子，在哺乳動(dòng)物中，存在三種亞型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1是最主要的、分布最廣泛，可通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)穩(wěn)態(tài)，包括經(jīng)典型和非經(jīng)典型信號(hào)途徑合成ECM，減少了調(diào)節(jié)ECM降解的蛋白酶MMPs的產(chǎn)生，促進(jìn)了蛋白酶體抑制子TIMPs、干擾素的表達(dá)，增加細(xì)胞粘附到基質(zhì)。異常的TGF-β1信號(hào)可引起大量與心衰有關(guān)的病理變化，如膨大的心肌病、心肌纖維化和梗死后心肌重塑等[15,16]。細(xì)胞內(nèi)的Smads途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1和相關(guān)因子的信號(hào)中起主要作用。Smads包括三個(gè)家族：受體激活型Smads(R-Smads)、一般型Smads和抑制型Smads(I-Smads)。Smad3是一種R-Smad，一旦受到TGF-β1磷酸化，激活的TGF-β1 可連接到I型和II型受體(TβR-II)受體，通過(guò)磷酸化TβR-I相關(guān)的Smads介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)[17]。

AngII作為細(xì)胞內(nèi)的活性分子，其發(fā)揮效應(yīng)需要與受體結(jié)合[18]。在心肌，AngII 連接到AT1誘發(fā)NADPH氧化酶(NOX)依賴的過(guò)氧化物生成，激活多條下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。心肌細(xì)胞可表達(dá)兩種NOX家族成員，分別為NOX2和NOX4[19]。在AngII處理的新生大鼠心肌細(xì)胞研究顯示，AngII激活產(chǎn)生超氧化物依賴于AT1和NOX2作用[20]。Yu YS等研究顯示，20周齡SHR大鼠心肌AngII水平、NOX4表達(dá)均增加[21]。

AngII已知介導(dǎo)了驅(qū)藥性炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞聚集，巨噬細(xì)胞異常積累在局部組織可增加TGF-β1水平，激活Smad3介導(dǎo)的信號(hào)通路[22]。Lijun Wang等通過(guò)研究糖尿病心肌病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子AngII能激活JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)TGF-β1蛋白表達(dá)，增加心肌中膠原的含量[23]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們同時(shí)測(cè)定了AngII、NOX2、TGF-β1、Smad3mRNA，結(jié)果顯示，與C組比較，28周齡SHR大鼠模型組(H組)大鼠以上各指標(biāo)均呈現(xiàn)非常顯著性增加(P<0.01)，提示AngII可能通過(guò)作用于NOX2介導(dǎo)TGF-β1/Smad3信號(hào)參與高血壓心肌間質(zhì)纖維化。已知長(zhǎng)期有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)能改善高血壓心肌間質(zhì)纖維化，在此之前的研究中，僅對(duì)其中某單一指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定研究，如Xu X等研究顯示，8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能減少左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起梗死的左心室重塑大鼠心肌的膠原容積分?jǐn)?shù)、AngII I型受體蛋白表達(dá)，增加金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)[24]。Agarwal 等研究顯示，16周有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低7周齡SHR大鼠血壓，降低其大腦(下丘腦室旁核和延髓頭端腹外側(cè)區(qū))中促炎因子和抗炎因子之間的平衡以及RAS成分(血漿AngII)[25]。Filho AG等研究顯示，8周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能顯著降低SHR大鼠血漿AngII水平，參與心肌重塑的改善[26]。相關(guān)的研究還顯示，12周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能較好的減少衰老大鼠心肌中的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，改善年齡相關(guān)的心臟細(xì)胞外基質(zhì)，表現(xiàn)為心肌中TIMP、TGF-β表達(dá)下調(diào)而MMPs上調(diào)[27]。Serra A J等研究顯示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能顯著降低由β-腎上腺素所介導(dǎo)的大鼠心肌中促炎因子TGF-β1mRNA，改善心功能[28]。而有氧運(yùn)動(dòng)能否通過(guò)該通路改善高血壓心肌纖維化尚未被研究。為此，我們測(cè)定了高血壓大鼠AngII、NOX2、TGF-β1、Smad3mRNA，首次研究AngII/TGF-β1/Smad3在運(yùn)動(dòng)改善高血壓心肌間質(zhì)纖維化中的作用，結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組大鼠AngII、NOX2、TGF-β1、Smad3mRNA均顯著低于高血壓模型對(duì)照組，表明AngII/TGF-β1/Smad3通路參與其中。

3.3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌HSP90蛋白表達(dá)的影響

HSPs是一組強(qiáng)大的分子伴侶，在受到各種生理和環(huán)境攻擊時(shí)被介導(dǎo)。HSP90占到細(xì)胞質(zhì)蛋白的1～2%，控制細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的折疊和胞內(nèi)運(yùn)輸。研究顯示，HSP90還能與細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化，如HSP 90能調(diào)控NF-κB、Raf-1和JNK的活性，參與細(xì)胞凋亡[29,30]。Jun-ichi O研究發(fā)現(xiàn)，在4周高鹽飲食介導(dǎo)的高血壓心肌肥大模型中，心肌間質(zhì)和血管周纖維化增加的同時(shí)，伴有HSP 90蛋白表達(dá)顯著性升高，提示HSP 90蛋白可能通過(guò)直接或間接形式參與對(duì)高血壓心肌間質(zhì)纖維化的調(diào)控[31]。我們的研究對(duì)象為自發(fā)性高血壓大鼠，結(jié)果顯示，與正常血壓對(duì)照組比較，SHR模型組大鼠心肌中HSP 90蛋白表達(dá)顯著性升高。

關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌HSP90的研究尚未見到。而骨骼肌和主動(dòng)脈的相關(guān)研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)能增加HSP90活性，參與eNOS的活性增加，因?yàn)閑NOS產(chǎn)生NO的能力部分是由其與HSP 90之間的相互作用決定，最終參與骨骼肌和主動(dòng)脈氧化還原平衡以及對(duì)血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[32,33]。在本研究中，我們首次探討HSP90在高血壓心肌纖維化重塑中的改善作用，結(jié)果顯示，與高血壓模型對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌中HSP90蛋白表達(dá)水平增加，分析這種變化的原因可能與HSP90對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性增加的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

在本研究中，HSP 90在高血壓心肌中表達(dá)增加，而在游泳運(yùn)動(dòng)會(huì)出現(xiàn)繼續(xù)增加。分析這兩種不同的狀態(tài)下的可能原因是，在高血壓病理性心肌重塑狀態(tài)下，氧化應(yīng)激激活了熱休克反應(yīng)，在游泳運(yùn)動(dòng)的熱休克反應(yīng)的增加是減少了心肌中的脂質(zhì)過(guò)氧化水平狀態(tài)[34]，這在本實(shí)驗(yàn)的NOX2蛋白表達(dá)的變化可得到一定的驗(yàn)證。此外，在前人的相關(guān)研究中，談到在病理性心肌重塑的狀態(tài)下HSP 90蛋白增加，這是一種補(bǔ)償機(jī)制來(lái)促進(jìn)eNOS活性增加NO，但是這種補(bǔ)償機(jī)制最終無(wú)法阻止病理性心肌重塑(包括心肌肥大和心肌間質(zhì)纖維化等)的進(jìn)展，而通過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，可進(jìn)一步促進(jìn)HSP 90蛋白的表達(dá)，再次建立起來(lái)的HSP90與eNOS之間的相互作用可能促進(jìn)了內(nèi)源性eNOS產(chǎn)生NO的能力，這種代償作用在一定程度上改善了心肌間質(zhì)纖維化[35]，這種機(jī)制是否存在于本研究的高血壓心肌間質(zhì)纖維化中，對(duì)此還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

游泳運(yùn)動(dòng)能較好地改善SHR大鼠心肌間質(zhì)纖維化，降低colI、colIII蛋白表達(dá)，主要通過(guò)降低AngII介導(dǎo)NOX2表達(dá)，抑制下游TGF-β1/Smad3通路激活，其中HSP90作為其上游因子，在其中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。