王 兵,侯 俊

(1.西安工業(yè)大學(xué) 體育學(xué)院,西安 710021；2.洛陽師范學(xué)院 體育學(xué)院,洛陽 471022)

骨質(zhì)疏松是一類以骨質(zhì)丟失、骨小梁數(shù)量減少和骨微結(jié)構(gòu)退化為特征的代謝性疾病[1],好發(fā)于中老年人群體.通常情況下,骨質(zhì)疏松的癥狀并不明顯,直至骨折的發(fā)生.骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折主要發(fā)生在脊椎、股骨近端和前臂遠(yuǎn)端等[2],這些部位又屬于身體承受力量較為突出的部位.骨質(zhì)疏松性骨折的高致殘率和致死率給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來沉重的壓力.年齡是骨質(zhì)疏松和相關(guān)骨折發(fā)生的一個(gè)重要的獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子，隨著衰老的進(jìn)程,骨質(zhì)疏松發(fā)生的概率明顯增加[3].中國是世界上老齡化最嚴(yán)重的國家之一.根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局《2014年國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》,2014年中國13.67 億人口中,60歲以上的人口數(shù)目占總?cè)丝诒壤秊?5.5%；而65歲以上人口數(shù)目占比達(dá)到10.1%.而中國的老齡化進(jìn)程速度更是世界第一[4].一項(xiàng)meta分析調(diào)查發(fā)現(xiàn)在過去的12年里,中國骨質(zhì)疏松的發(fā)生率明顯增加(在2008年之前為14.94%,而在2012-2015年里發(fā)生率增加至27.96%)；目前50歲以上老人的骨質(zhì)疏松發(fā)生率已經(jīng)達(dá)到2006年的1.5倍[5].大量的研究報(bào)道說明維生素D的缺乏是造成骨質(zhì)疏松最為危險(xiǎn)的要素之一.與此同時(shí),有大量的臨床證據(jù)顯示，長期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相比藥物治療,因?yàn)槠浣?jīng)濟(jì)性和安全性,可以顯著增加老年人群的骨質(zhì),減少骨質(zhì)疏松以及相關(guān)骨折的發(fā)生[6-8].然而長期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練骨保護(hù)作用的分子機(jī)制仍然不清,因此，該領(lǐng)域的研究目前是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前最為關(guān)注的話題之一.

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種慢性、進(jìn)行性的以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征,易導(dǎo)致一些常見部位,例如椎體、髖部以及腕部發(fā)生脆性骨折的疾病,是體內(nèi)外多種因素共同作用的結(jié)果,但是老齡化是主要的誘因.以往研究主要關(guān)注更年期婦女常見的絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥,然而近年來發(fā)現(xiàn)男性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者比例日益增高.如何通過有效地非藥物性手段介入成為研究關(guān)注的重點(diǎn).維生素D為固醇類衍生物,體內(nèi)維生素D主要來源于食物補(bǔ)充或者通過皮膚中7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射生成,經(jīng)過一系列羥基化等作用最終生成維生素D的活性形式1,25-(OH)2D3[9].該研究成果目前已經(jīng)得到同行專家學(xué)者的廣泛認(rèn)同,并在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中得到有效的驗(yàn)證,但轉(zhuǎn)化機(jī)理有待進(jìn)一步的發(fā)掘.維生素D可以促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收,從而維持體內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)[10].根據(jù)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)及上述實(shí)驗(yàn)研究成果,小腸是鈣離子吸收最為積極和有效的場(chǎng)所,但是對(duì)于其他部位的鈣離子吸收能力及吸收效能并沒有詳細(xì)的闡述,所以該領(lǐng)域的研究亟待發(fā)掘和實(shí)驗(yàn)佐證.維生素D還可以促進(jìn)骨組織對(duì)鈣和磷的吸收,促進(jìn)骨骼的礦化[11].這說明維生素D水平與骨密度關(guān)系密切,當(dāng)體內(nèi)維生素D水平不足時(shí)可導(dǎo)致骨密度降低.但維生素D不能直接發(fā)揮作用,需要通過其生物活性物質(zhì)1,25-(OH)2D3的與其核受體VDR結(jié)合完成[12].1,25-(OH)2D3/VDR信號(hào)通路可以通過調(diào)節(jié)OPG,RANKL以及Wnt/β-catenin等通路來維持骨組織的健康[13].所以單純的維生素D能夠促進(jìn)骨骼生長發(fā)育并提高骨密度并非直接作用結(jié)果,缺乏陽光作用,維生素D并不能在機(jī)體骨密度改善方面發(fā)揮主導(dǎo)作用.現(xiàn)有原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者治療的基本方式是攝入維生素D及鈣制劑.但若伴有其他病理情況時(shí),維生素D的攝入易導(dǎo)致過量等,因此，在藥物以外尋求更為安全的方式成為臨床實(shí)踐的方向.大量研究表明,通過合理的運(yùn)動(dòng)可以提高原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的BMD,但其中的機(jī)制除了已被證實(shí)的生物力學(xué)刺激以外,是否還與維生素D水平有關(guān)?研究發(fā)現(xiàn)成年2型糖尿病大鼠經(jīng)過適度的游泳訓(xùn)練可以增加大鼠血清中維生素D的水平[14].雖說實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以有效地說明糖尿病大鼠通過游泳實(shí)驗(yàn)可以有效地提高體內(nèi)維生素D的水平,但是糖尿病本身對(duì)于骨質(zhì)疏松是否產(chǎn)生消極作用文章并沒有實(shí)驗(yàn)對(duì)比,這也為后期進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)研究預(yù)留了足夠的空間,同時(shí)也為有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于糖尿病患者有益的相關(guān)研究提供了方向.VDR是類固醇激素受體家族當(dāng)中的一員,他與1,25-(OH)2D3激素信號(hào)分子在靶細(xì)胞結(jié)合后形成相應(yīng)復(fù)合物,該復(fù)合物再與視黃醛X受體形成雜二聚體后與維生素D受體反應(yīng)元件結(jié)合,從而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)控后實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能,主要調(diào)節(jié)鈣和磷的代謝.研究表明，它是核內(nèi)能夠介導(dǎo)發(fā)揮生物效應(yīng)的一種生物大分子,分布在機(jī)體的許多組織中,包括骨、腎臟、心臟和血管等.從現(xiàn)有研究成果來看,VDR基因多態(tài)性與人類的壽命和晚年健康密切相關(guān)[15].最近的研究顯示，VDR可以通過調(diào)節(jié)klotho和成纖維細(xì)胞生長因子-23參與過早老化的過程調(diào)控[16-17].上述研究成果說明，VDR在維生素D的轉(zhuǎn)化利用等方面發(fā)揮著積極的作用,并由此對(duì)骨骼的健康成長起到了積極的作用.文獻(xiàn)[18]研究顯示抗阻訓(xùn)練(不同于本文的耐力訓(xùn)練)可以在短時(shí)間內(nèi)增加大鼠骨骼肌肌肉中VDR的表達(dá)；而短時(shí)間的耐力訓(xùn)練則對(duì)大鼠肌肉中VDR的表達(dá)沒有明顯改變.在成年2型糖尿病大鼠中,4周的適度游泳訓(xùn)練(另一種耐力訓(xùn)練)則可以增加肌肉中VDR的表達(dá)[14].

本文以老年大鼠為研究對(duì)象,觀察長期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年大鼠骨質(zhì)疏松治療作用的同時(shí),檢測(cè)大鼠血液中維生素D的水平以及骨組織中維生素D受體的表達(dá)水平,觀察長期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠維生素D通路的影響,嘗試有效地說明維生素D在骨質(zhì)疏松預(yù)防方面的作用機(jī)制,并嘗試解釋長期有氧運(yùn)動(dòng)“骨保護(hù)”作用的潛在機(jī)制.本研究則發(fā)現(xiàn)12周的遞增強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以增加骨組織中VDR的表達(dá).

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

2月齡雄性F344大鼠(n=10)及23月齡雄性F344大鼠(n=30)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),動(dòng)物組織檸檬酸合酶活性檢測(cè)試劑盒(比色法,上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司),1,25-(OH)2D3檢測(cè)試劑盒(英國Immuno Diagnostic生物試劑公司).

1.2 運(yùn)動(dòng)方式

2月齡雄性F344大鼠做為年青對(duì)照組(Young).參考以往研究文獻(xiàn)[7],有氧訓(xùn)練通過12周實(shí)驗(yàn)室自制大鼠用跑臺(tái)完成.經(jīng)過改良后的具體訓(xùn)練方案為：將大鼠放置于電動(dòng)跑步機(jī)上,傾斜角設(shè)置為10°,訓(xùn)練強(qiáng)度遞增.第1～2周,每天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)0.5 h,速度設(shè)置為8 m·min-1；第3～4周,每天運(yùn)動(dòng)45 min,速度設(shè)置為12 m·min-1；第5～12周每天運(yùn)動(dòng)1 h,速度設(shè)置為20 m·min-1.

實(shí)驗(yàn)大鼠非運(yùn)動(dòng)年青和老年大鼠僅將其放置于跑臺(tái)上,速度為零,放置時(shí)間與運(yùn)動(dòng)組大鼠的安排相同.23月齡雄性F344大鼠隨機(jī)分為非運(yùn)動(dòng)組(Aged)和運(yùn)動(dòng)組(Aged+EX),按照運(yùn)動(dòng)方案持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練12周之后稱量體重,“頸椎脫臼法”安樂死方式處死動(dòng)物,動(dòng)物處理符合相關(guān)的政策法規(guī),實(shí)驗(yàn)全程保證最終取材的每組動(dòng)物數(shù)目為9只.取材(股骨、椎骨)用于測(cè)量骨密度值.分離比目魚肌,通過試劑盒檢測(cè)肌肉中“檸檬酸合成酶”活性,用于評(píng)價(jià)長期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的效果.

1.3 骨密度的檢測(cè)

剝離左側(cè)股骨和椎骨,去除結(jié)締組織和肌肉,使用DEXA雙能X線骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨和L2-5段椎骨的骨密度.

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

檢測(cè)完骨密度的股骨和椎骨,置入研缽,加入液氮,然后將骨組織研磨粉碎,加入Trizol溶液提取總的RNA,應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)單鏈DNA,設(shè)置定量RT-PCR反應(yīng)體系,維生素D受體(VDR)基因引物序列：上游5’-ACAGTCTGAGGCCCAAGCTA-3’；下游5’-CTGGTCATCGGAGGTGAGAT-3’.將GAPDH設(shè)為內(nèi)參基因,引物為：上游5’-GAGCTGAATGGGAAGCTCAC-3’；下游5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGAGT-3’.ABI7500定量PCR儀檢測(cè),通過OpticonMonitorTMsoftware軟件分析數(shù)據(jù).最終結(jié)果以Young組的倍數(shù)表示.

1.5 血清中1,25-(OH)2D3(維生素D的活性形式)水平的檢測(cè)

大鼠處死后,迅速通過腹主動(dòng)脈放血收集血液,放置1 h,200 g離心分離出血清,-20 ℃保存.應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中1,25-(OH)2D3水平.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

最終結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,組間顯著性差異檢驗(yàn)通過t檢驗(yàn)完成,當(dāng)P值小于0.05時(shí),認(rèn)為組間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體重、肌肉檸檬酸合成酶及骨密度的影響

在VDR基因敲除小鼠中出現(xiàn)了許多過早老化的現(xiàn)象,包括存活率低下，過早脫發(fā)，皮膚變厚，表皮囊腫以及骨質(zhì)疏松等[19].而且研究發(fā)現(xiàn)，VDR受體的數(shù)量隨著年齡的增長而減少,這一點(diǎn)可能會(huì)降低老年人的肌肉力量,進(jìn)而影響到骨骼的質(zhì)量.另一方面,有研究也發(fā)現(xiàn)，VDR數(shù)量減少伴隨衰老出現(xiàn)的同時(shí)還有骨組織中VDR的表達(dá)也減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明：非運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練狀態(tài)下,老年(Aged)大鼠與青年大鼠(Young)相比,體重(圖1(a))明顯增加(用*表示：p<0.05),但比目魚肌中檸檬酸合酶活性(圖1(b))變化不明顯,而股骨(圖1(c))和椎骨(圖1(d))的骨密度(BMD)則明顯下降.與之不同的是,經(jīng)過12周持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(EX)的老年大鼠,盡管體重稍高于非運(yùn)動(dòng)的青年大鼠,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而與非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的老年大鼠比較,體重則顯著下降,而且肌肉中檸檬酸合酶活性增加,股骨和椎骨的骨密度也明顯增加(用#表示：p<0.05).

圖1 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以顯著減輕衰老引發(fā)的骨質(zhì)丟失

2.2 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠維生素D的水平的影響

實(shí)驗(yàn)采用血清中維生素D的生物活性形式1,25-(OH)2D3代表維生素D的營養(yǎng)狀況.如圖2所示,非運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練狀態(tài)下,老年大鼠與青年大鼠相比,血清中1,25-(OH)2D3水平(圖2)明顯降低(用*表示：p<0.05)；而經(jīng)過12周持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(EX)的老年大鼠,其血清中1,25-(OH)2D3水平與非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的老年大鼠相比,呈現(xiàn)輕微增加,而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.研究中發(fā)現(xiàn)，12周的跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)老年大鼠血清中維生素D的水平并無顯著影響,分析可能是不同的耐力運(yùn)動(dòng)形式,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間及不同病理情況所導(dǎo)致.但實(shí)踐中,對(duì)于老年患者來說,低強(qiáng)度的持續(xù)步行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式更易接受.因而,為了探究持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者骨組織的保護(hù)機(jī)制,本文進(jìn)行了進(jìn)一步探索.

2.3 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠骨組織中維生素D受體(VDR)表達(dá)的影響

衰老條件下,隨著1α羥基化的缺乏,1,25-(OH)2D3的合成減少[20]；以及體內(nèi)1,25-(OH)2D3的分解代謝增加[21],從而體內(nèi)1,25-(OH)2D3的水平減少.而1,25-(OH)2D3的減少也證實(shí)與骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生密切相關(guān)[22];人為地誘導(dǎo)維生素D缺乏也可以導(dǎo)致健康人骨出現(xiàn)衰老的現(xiàn)象,增加骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[23].

圖2 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)維生素D的水平?jīng)]有顯著影響

從現(xiàn)有研究成果來看,1,25-(OH)2D3能夠有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖,同時(shí)促進(jìn)堿性磷酸酶的活性和數(shù)量,Zanello和他的同伴通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),給小鼠進(jìn)行人工喂養(yǎng)1,25-(OH)2D3,后期發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的離子通道活性發(fā)生變化[24],這說明1,25-(OH)2D3對(duì)于骨的形成發(fā)揮著積極的作用.體內(nèi)維生素D 主要通過其活性形式1,25-(OH)2D3與VDR結(jié)合發(fā)揮作用.如圖3所示,非運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練狀態(tài)下,老年大鼠與青年大鼠相比,股骨(圖3(a))和椎骨(圖3(b))骨組織中VDR的mRNA水平明顯下降.而經(jīng)過12周持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(EX)的老年大鼠,其股骨和椎骨骨組織中VDR的mRNA水平與非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的老年大鼠相比明顯增加.本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年雄性大鼠血液中維生素D水平和骨組織中VDR的表達(dá)水平明顯降低，提示老年男性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可能與維生素D營養(yǎng)狀況及其作用發(fā)揮有關(guān).

圖3 持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以顯著增加老年大鼠骨組織中VDR的表達(dá)

3 結(jié) 論

1) 非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,老年大鼠的股骨和椎骨的骨密度相較于青年大鼠明顯下降；長期持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加老年大鼠的股骨和椎骨的骨密度,提示持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以顯著減輕衰老引發(fā)的骨質(zhì)丟失.非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,與青年大鼠相比,老年大鼠血清中1,25-(OH)2D3水平降低；長期持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)之沒有明顯影響.非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,與青年大鼠相比,老年大鼠股骨和椎骨的骨組織中維生素D受體(VDR)表達(dá)明顯降低；長期持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加老年大鼠的股骨和椎骨中VDR的mRNA表達(dá).運(yùn)動(dòng)可以通過部分激活1,25-(OH)2D3/VDR信號(hào)通路,最終有助于減輕由于衰老誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松,該研究至少部分解釋了在衰老性骨質(zhì)疏松中長期有氧運(yùn)動(dòng)骨保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制.

2) 長期持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練上調(diào)老年大鼠骨組織中維生素D受體的表達(dá),該結(jié)果可以部分解釋長期持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年大鼠骨組織保護(hù)機(jī)制.鑒于運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠體內(nèi)維生素D的水平?jīng)]有明顯影響,提示可以通過給予外源性維生素D補(bǔ)充配合運(yùn)動(dòng)療法,來促進(jìn)骨的生長,從而起到更好的骨保護(hù)作用.

3) 應(yīng)該考慮到不同的運(yùn)動(dòng)模式對(duì)老年大鼠骨組織維生素D受體表達(dá)的差異性,在老年大鼠的研究成果基礎(chǔ)上,為獲得老年人群運(yùn)動(dòng)模式轉(zhuǎn)變對(duì)身體素質(zhì)及體質(zhì)發(fā)展的相關(guān)研究成果提供了目標(biāo)和方向.