顧清，張莉，張新星，代小松，陳和平

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，成都610072)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡病例數(shù)約68萬，其中約50萬在中國[1]。多數(shù)胃癌患者就診時(shí)已處于中晚期，以手術(shù)切除為基礎(chǔ)并輔助放化療的綜合治療方案是目前主要的臨床治療策略，然而放化療耐藥、對其他組織器官的侵襲等嚴(yán)重制約了胃癌患者的治療效果，胃癌患者的預(yù)后不佳，臨床亟需尋找新的與胃癌治療相關(guān)的生物靶分子[2]。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)可與富含GC序列的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。KLF在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，如血管形成[3]、腫瘤形成[4,5]等。研究證實(shí)，KLF2可通過上調(diào)p15和p21基因表達(dá)，抑制腫瘤增殖[6]。KLF16是Kaczynski等[7]在2002年鑒定的一個(gè)新的KLF家族成員，可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，而關(guān)于KLF16在胃癌中的表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道甚少。2016年1月～2017年10月，我們檢測了KLF16在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，并探討了其對胃癌細(xì)胞增殖、克隆能力的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細(xì)胞株GES-1、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27和AGS(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和雙抗(美國Gibco公司)，免疫組化試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab187973,IHC-P，美國Abcam公司)，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Real-time PCR引物序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，shRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，CCK-8溶液(上海翊圣生物科技有限公司)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(北京凱瑞基生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab175892，美國Abcam公司)，兔抗人p21單克隆抗體(ab109520，美國Abcam公司)，兔抗人周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)單克隆抗體(ab108357，美國Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab9485，美國Abcam公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。紫外分光光度計(jì)(ND-2000，美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀(7600，美國ABI公司)，酶標(biāo)儀(ELX800，美國伯騰儀器有限公司)，凝膠成像儀(2500R，上海天能科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取人胃上皮細(xì)胞株GES-1及人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27、AGS，均培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含雙抗+10% FBS)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，取復(fù)蘇后第4～10代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞中KLF16 mRNA相對表達(dá)量檢測 取約5×104個(gè)處于對數(shù)生長期的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞，每種細(xì)胞分為3組，接種于6孔板中，24 h后，sh-KLF16 1#、2#、3#組采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000，分別將sh-KLF16 1#(5′-AGC GCT TCA CCC GCA GTG A-3′)、sh-KLF16 2#(5′-GTG CTC ATG GCC ATC TCT T-3′)、sh-KLF16 3#(5′-CGC ACC TAA AGT CGC ACCT-3′)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，sh-NC組將shRNA無關(guān)序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以不轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞為空白對照組。操作步驟參照試劑說明書。轉(zhuǎn)染后12 h，Real-time PCR法檢測KLF16 mRNA相對表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次?；虮磉_(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 細(xì)胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液，接種至96孔板中，接種密度約8 000/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值，計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均值。試驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞克隆數(shù)目測算 制備1.2%和0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，置于40 ℃水??；按1∶1比例，制備1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養(yǎng)基(2×雙抗和20%FBS)的混合液，取混合液2 mL至6孔板中，冷卻凝固備用；取轉(zhuǎn)染后的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L；按1∶1比例，制備0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養(yǎng)基(含20% FBS和2×雙抗)的混合液，再加入細(xì)胞懸液200 μL，充分混勻，取適量(約500個(gè)細(xì)胞)加入至上述6孔板中，形成雙層瓊脂層，凝固后，置于培養(yǎng)箱中10～14 d，觀察并記錄細(xì)胞克隆數(shù)目。試驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞約1×106個(gè)，加入RIPA蛋白裂解液150 μL，充分裂解后，提取細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉30 min，TBS-T溶液洗滌1次，分別加入兔抗人KLF16多克隆抗體，兔抗人p21單克隆抗體，兔抗人CDK4單克隆抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體室溫孵育1 h。TBS-T溶液洗滌3次，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS-T溶液洗滌3次，ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對圖像進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。試驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組KLF16 mRNA相對表達(dá)量比較 BGC-823細(xì)胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達(dá)量分別為1.13±0.10、1.06±0.15、0.57±0.11、0.72±0.14、0.39±0.13，SGC-7901細(xì)胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達(dá)量分別為1.09±0.12、1.02±0.14、0.59±0.15、0.53±0.11、0.31±0.15；兩種細(xì)胞中，sh-KLF16 #3組的KLF16 mRNA相對表達(dá)量低于sh-KLF16 #1組和sh-KLF16 #2組(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞增殖活性比較 在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中，與空白對照組和sh-NC組相比，sh-KLF16 3#組轉(zhuǎn)染48、72 h細(xì)胞增殖活性低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h后細(xì)胞增殖活性比較

注：與同時(shí)點(diǎn)空白對照組和sh-NC組相比，*P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞克隆數(shù)目比較 BGC-823細(xì)胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細(xì)胞克隆數(shù)目分別為(180.45±19.32)、(189.83±22.43)、(109.32±24.31)個(gè)；SGC-7901細(xì)胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細(xì)胞克隆數(shù)目分別為(148.41±21.43)、(152.95±24.75)、(87.82±18.43)個(gè)；sh-KLF16 3#組細(xì)胞克隆數(shù)目低于空白對照組、sh-NC組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 平板克隆形成試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成能力(×200)

2.4 各組細(xì)胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達(dá)比較 BGC-823細(xì)胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達(dá)量分別為1.13±0.10、0.84±0.12、1.21±0.18，sh-NC組分別為1.15±0.12、0.79±0.15、1.36±0.32，sh-KLF16 3#組分別為0.21±0.03、1.34±0.21、0.31±0.11。SGC-7901細(xì)胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達(dá)量分別為1.02±0.09、0.78±0.11、1.13±0.08，sh-NC組分別為1.09±0.13、0.69±0.22、1.09±0.14，sh-KLF16 3#組分別為0.26±0.07、1.38±0.28、0.42±0.08。在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中，干擾KLF16基因表達(dá)后，p21蛋白表達(dá)增加，而CDK4蛋白表達(dá)下降(P均<0.05)。

3 討論

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌[8]。手術(shù)切除可有效改善胃癌患者的預(yù)后，但患者的5年總生存率僅29%左右。目前已有多個(gè)靶向治療藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但效果并不理想[9,10]，臨床仍亟需尋找能有效靶向治療胃癌的生物靶標(biāo)。

KLF是真核細(xì)胞中一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，以細(xì)胞周期和啟動(dòng)子依賴性的方式參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。KLF在腫瘤形成和惡性進(jìn)展中發(fā)揮多種功能，如KLF2通過調(diào)節(jié)p15和p21表達(dá)，在肺癌中發(fā)揮抑癌基因功能[6]；KLF4可抑制胰腺癌[11]、胃癌[12]和結(jié)腸癌[13]等腫瘤細(xì)胞增殖。此外，KLF15被證實(shí)在乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因功能[14]。目前，關(guān)于KLF16的研究主要集中于代謝和內(nèi)分泌方面[15]，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，KLF16可抑制神經(jīng)突起生長，導(dǎo)致軸突冠萎縮[16]；此外，KLF16可減少PPARγ表達(dá)進(jìn)而抑制脂肪生成[17]，而在KRAS癌基因突變的腫瘤細(xì)胞中，KLF16可抑制細(xì)胞增殖[18]。

本研究結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中干擾KLF16基因表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和克隆形成能力被顯著抑制，鑒于現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，推測KLF16可能參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。研究證實(shí)，p21蛋白通過其N末端特異性地與PCNA、Cyclin-CDK結(jié)合，抑制CDK活性，阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖；CDK4蛋白正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，CDK4高表達(dá)促進(jìn)多種腫瘤的惡性進(jìn)展[18]。本研究中，Western blotting試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中KLF16基因表達(dá)，可顯著增加p21蛋白表達(dá)，同時(shí)降低CDK4蛋白表達(dá)，提示KLF16表達(dá)下降，可能導(dǎo)致了細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖。

綜上所述，干擾KLF16基因表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力。KLF16發(fā)揮癌基因的功能可能是通過上調(diào)CDK4和下調(diào)p21表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯實(shí)現(xiàn)。KLF16可作為胃癌患者治療和預(yù)后預(yù)測的生物靶標(biāo)，后續(xù)研究將繼續(xù)探討KLF16對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的具體內(nèi)在機(jī)制。