彭霈，曹秉振

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南250031)

熱射病是一種致死性急癥，臨床上以較高的核心溫度、皮膚干燥伴嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害(如譫妄、抽搐、昏迷)為主要臨床表現(xiàn)[1]。盡管熱射病發(fā)生時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷由病理及影像學變化可直接觀測到[2];但在全身炎性反應綜合征發(fā)生時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性因子發(fā)生變化的機制仍未明了。已有多個學者發(fā)現(xiàn)，熱射病發(fā)生時巨噬細胞分泌的細胞因子水平發(fā)生了變化[3，4]，巨噬細胞的極化方向與炎性因子密切相關。巨噬細胞的極化[5]分為M1型和M2型，M1型為促炎性因子型，常見的M1型表面標志物有HLA-DR、CD197、誘導型一氧化碳合酶(iNOS)等[6]；M2型為抗炎性因子型，M2型表面標志物有CD206、CD301、Ⅰ型精氨酸酶(ArgⅠ)等[7]。2016年3～6月，本實驗選取iNOS、ArgⅠ分別作為兩種極化方向的指標檢測，探討熱射病模型大鼠巨噬細胞的極化方向。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級Wistar大鼠40只(36只+儲備4只)，體質量200～250 g，8周左右，購自山東大學齊魯醫(yī)學院動物中心。適應性生長2周后開始用于實驗?？煽厥胶銣叵滟徸陨綎|瑞科電器公司；Aanti-CD68 antibody購自美國abcam公司；BX41顯微鏡、倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯光學工業(yè)株式；RPMI-1640不完全培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細胞核、漿蛋白抽取試劑盒，BCA蛋白質定量試劑盒購自上?？党缮锕?；iNOS(稀釋比1∶2 000)、ArgⅠ(稀釋比1∶2 000)購自美國abcam公司；Horseradish Peroxidase(HRP)結合的二級抗體、HRP-結合的抗生物素抗體購自上?？党缮?；Western顯影液、定影液購自上海冠龍照相器材公司；Western掃描儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 動物分組及處理 將實驗動物共分為熱暴露即刻組，熱暴露后1 d、2 d、3 d、7 d組，對照組共6組，每組6只。實驗組動物給予熱暴露溫度40 ℃，相對濕度60%，照射100 min建立熱射病大鼠模型。對照組不給予任何處理。

1.3 脾臟巨噬細胞的提取及鑒定 通過對南方醫(yī)科大學的熱射病復合內毒素感染模型[8]的改裝，并借鑒臺灣學者的模型[9]，構建熱射病大鼠模型。通過借鑒法舒地爾治療自身免疫性腦脊髓炎[10]一文中小鼠脾臟巨噬細胞的分離方法，并結合國內對人、大鼠脾臟巨噬細胞分離技術[11]的研究進展，取得大鼠脾臟巨噬細胞。具體步驟如下：大鼠熱射病造模結束后，水合氯醛4 mL/kg注射麻醉，然后無菌取出脾臟組織，通過清洗組織、制備細胞混懸液后，向沉淀中加入適量RPMI-1640不完全培養(yǎng)基，吹打、混勻，調整細胞濃度為2×106/mL，接種至一次性塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，使培養(yǎng)瓶底細胞分布均勻，轉移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4小時觀察細胞的生長狀況，培養(yǎng)12 h細胞貼壁度達到較佳狀態(tài)時，取出至鏡下觀察。胎盤蘭染色法鑒定細胞活力均在95%以上，瑞氏-姬姆薩染色法鑒定巨噬細胞純度較高，在90%以上。運用細胞免疫組化法，顯微鏡下檢測出細胞CD68抗體的陽性表達，即可定性鑒定為巨噬細胞。

1.4 脾臟巨噬細胞iNOS、ArgⅠmRNA表達的檢測 采用實時定量PCR法。取出凍存的脾臟巨噬細胞，在37 ℃的水浴箱中復溫，隨后接種至一次性塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細胞用PBS液清洗、勻漿使核酸蛋白體完全解離、離心提取細胞的全部RNA，使用NanoDrop?ND-1000測定RNA的濃度和純度。按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉錄為cDNA，然后進一步進行PCR擴增。引物序列：iNOS：F:5′TTGGAGCGAGTTGTGGATTG3′，R:5′TGAGGGCTTGCCTGAGTGA3′。Arg Ⅰ：F:5′AACGGGAAGGTAATCATAAGCC3′，R:5′GCCTGGTTCTGTTCGGTTTG3′。PCR反應體系包括2 Master Mix 5 μL,F和R各0.5 μL，加水共8 μL，取cDNA 2 μL,反應條件：95 ℃、10 s，60 ℃、60 s,40個循環(huán)。將熱應激處理后不同時間點的各組細胞樣品分別進行iNOS、ArgⅠ兩因子和GAPDH管家基因進行PCR反應。從機器中直接獲得待檢測因子的濃度結果，待測基因最終得到的相對濃度值可由管家基因給予校正，將機器自動生成的目的基因數(shù)值作為分子，各組樣品管家基因的數(shù)值作為分母，兩者相除后即可得到。

1.5 脾臟巨噬細胞iNOS、ArgⅠ蛋白表達的檢測 采用Western blotting法。首先用蛋白質抽提試劑提取大鼠脾臟巨噬細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳法分離細胞蛋白質，隨后轉移至PVDF膜，5%BSA溶液完全浸潤，加iNOS、ArgⅠ試劑盒中的一抗，4 ℃放置過夜，TBST緩沖液清洗5 min，共3次，滴加HRP標記的二抗，室溫孵育60 min，TBST緩沖液清洗5 min，共3次。取KCTM試劑盒，兩試劑等量混合，放入PVDF膜，室溫下反應3 min，固定，晾干，觀察結果。使用電腦Image J軟件自動分析檢測結果，將圖片上得到的條帶定量計算出所檢測的兩種目的蛋白的灰度值。

2 結果

2.1 脾臟巨噬細胞的鑒定 顯微鏡下觀察細胞呈圓形或橢圓形，排列密集，界限清晰，胞質內容物豐富，富含顆粒狀物質，呈嗜酸性胞質。核仁呈圓形，清晰可見。免疫組化法測定巨噬細胞CD68抗體陽性表達。

2.2 各組iNOS、ArgⅠ表達比較 熱暴露即刻組，熱暴露后1、2、3、7 d組及對照組iNOS mRNA分別為0.071±0.020、0.045±0.020、0.059±0.02、0.026±0.005、0.171±0.086、0.129±0.270，ArgⅠmRNA分別為0.048±0.018、0.072±0.005、0.156±0.003、0.172±0.012、0.179±0.013、0.131±0.015。熱暴露即刻組，熱暴露后1、2、3、7 d組及對照組iNOS蛋白分別為0.208±0.087、0.168±0.074、0.116±0.039、0.076±0.012、0.282±0.086、0.468±0.145，ArgⅠ蛋白分別為0.210±0.032、1.196±0.243、1.259±0.121、1.346±0.332、1.408±0.103、0.832±0.109。與對照組iNOS mRNA及蛋白相比，除熱暴露后7 d組差異無統(tǒng)計學意義外，余各組均降低(P均<0.05)。與對照組ArgⅠmRNA及蛋白比較，熱暴露后1 d組低(P<0.05)，熱暴露后2 d、3 d、7 d組逐漸升高(P均<0.05)。

注：對-1，即-1,1-1,2-1,3-1,7-1分別代表對照組、熱暴露過后即刻組、熱暴露后1 d組、熱暴露后2 d組、熱暴露后3 d組、熱暴露后7 d組。

圖1iNOS、ArgⅠ在細胞中的蛋白表達

3 討論

脾臟是機體最主要的免疫器官，調節(jié)機體的特異性及非特異性免疫反應，在聯(lián)系循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)間起著主要的橋梁作用。按組織結構成分來說，白髓和紅髓共同構成脾臟組織。白髓相當于淋巴結的白質，主要用于對抗外界微生物及感染應激。紅髓主要用來儲存及過濾血液，分為脾索、脾血竇。巨噬細胞即附著于血竇的壁上，其具有強大的吞噬功能，可以吞噬、清除進入血液中的病原體，如細菌、血吸蟲等，衰老紅細胞的清除也由其完成，除此之外，脾索中還包括有淋巴細胞、樹突狀細胞。

巨噬細胞作為人體主要的免疫細胞，在炎性反應中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其所處的環(huán)境不同，巨噬細胞可表達不同的功能表型，包括經(jīng)典活化途徑激活的M1型和替代活化途徑激活的M2型。在脂多糖、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等因子的刺激下，巨噬細胞促進TNF-α、IL-1、IL-12、ROS等細胞因子和CCR7、CXCL9等趨化因子的分泌，向M1型方向發(fā)生極化，發(fā)揮促進炎性反應、吞噬病原物的作用，加重機體炎性損傷。而在IL-4、IL-13和糖皮質激素等的刺激下，巨噬細胞向M2型方向發(fā)生轉化，分泌抗炎因子IL-10和TGF-β、VEGF、EGF等，同時抑制IL-1、IL-6等促炎因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用及減輕組織損傷。

在熱射病病理機制的研究中，Moseley等學者認為當機體受到外界熱應激環(huán)境刺激時，體內產生大量的內毒素，并發(fā)了內毒素血癥，以脂多糖為主要成分的內毒素可進一步激活單核巨噬細胞釋放炎性因子，如TNF-α、IL-1等，進一步引發(fā)全身炎性反應及凝血功能障礙。發(fā)揮促炎功能的促炎因子如TNF-α、IL-1能同時誘導IL-6、IL-8等抗炎性因子的產生，機體內的各種細胞因子之間相互作用、互相促進，從而使各種因子的數(shù)量逐漸增加，形成一個龐大的細胞因子間的作用反應體系，最終發(fā)展成級聯(lián)式的炎性反應，導致多器官功能障礙綜合征。多數(shù)國內外學者在構建熱射病模型后，均監(jiān)測到血液中各種細胞因子的大量分泌[2]。

巨噬細胞的極化方向與內環(huán)境中炎性因子的分泌密切相關。單純構建的動物熱射病模型和與脂多糖復合動物模型中，血液標本的炎性因子均顯著增多，如TNF-α、IL-1、IL-6等。理論上，熱射病發(fā)生后機體迅速發(fā)生免疫反應，大量的炎性細胞因子分泌，巨噬細胞向M1型方向極化。文獻[12]顯示，低溫環(huán)境促進脂肪中巨噬細胞極化為M2型。有研究發(fā)現(xiàn)，低溫可通過IL-4/IL-13-Stat6信號通路的介導，誘導M2型細胞活化；進一步通過分泌兒茶酚胺類激素促進機體產熱，維持體溫恒定，保護機體免受低溫的損害。本實驗結果顯示，在熱射病發(fā)生后1 d，與M2型極化相關的ArgⅠ含量逐漸增加，提示向M2型方向轉變，起到抗炎作用、促進機體功能恢復。

從實驗結果看，熱應激即刻組兩種因子的表達量均減少，理論上熱應激刺激炎性因子的分泌，促使巨噬細胞發(fā)生極化，然而兩種目的檢測因子的表達量均減少，考慮到機體遭受外界應激刺激時巨噬細胞能夠迅速出現(xiàn)免疫反應，極化現(xiàn)象的發(fā)生或許可能在熱射病超急性期出現(xiàn)。其次，本實驗選取的時間點稍寬，熱應激超過24 h后，大鼠能夠適應性生存，也是細胞極化發(fā)生不明顯的一個考慮因素，后續(xù)試驗可增加造模成功24 h內的指標測量。在1 d后同組ArgⅠ的表達即高于iNOS，起到保護機體的作用，是否由于離開高熱環(huán)境后機體的保護及適應性的耐受有關，也是需要考慮的影響因素。

經(jīng)過對巨噬細胞分型的研究，諸多學者認為機體內環(huán)境的不穩(wěn)定性、體內的代謝狀態(tài)等較多因素影響細胞的類型，使其不斷變化；實際情況下細胞的分型不是很明顯，M1、M2的分型是細胞處于功能狀態(tài)的兩個對立方面的表現(xiàn)，大多數(shù)細胞以兩者之間的某種或某些狀態(tài)存在[13]；同時，對兩種極化方向的細胞表面標志物的研究也只是在一定層次水平上可以應用，缺乏特異性。機體受到熱刺激后處于一個不平衡的內環(huán)境，大量的炎性因子分泌，同時有少量的抗炎因子分泌，兩者之間既相互促進又互為抑制，兩種因子的動態(tài)不平衡增加了本實驗的難度。本實驗種屬選取大鼠，相對于免疫學研究較常用的小鼠免疫反應敏感性稍差。對指標的檢測采用實時定量PCR、Western blotting兩種方法檢測巨噬細胞的極化發(fā)生，操作方法具有直接、易于分析的優(yōu)點，相對于國外采用的磁珠分選細胞法，此方法簡單，但干擾因素多。后續(xù)實驗可結合流式細胞術方法檢測。因受動物種屬來源的限制，測定大鼠來源細胞極化的抗體種類可選擇小，本實驗選取iNOS、ArgⅠ兩個指標，盡管已明確兩因子代表兩種極化方向，但其敏感性及本實驗的方法學是否易于檢測出，也是本實驗需繼續(xù)深究的地方。

總之，本研究從巨噬細胞極化方向來研究熱射病的治療具有很大的創(chuàng)新性，同時也是近年來免疫性、代謝性疾病研究新熱點。巨噬細胞極化的不平衡與機體內環(huán)境的變化相關。即使是已經(jīng)極化為某一方向的巨噬細胞，當機體內環(huán)境發(fā)生改變或受到其他因子的刺激時，仍可能向其對立方向發(fā)生極化。繼續(xù)深入研究巨噬細胞極化的發(fā)生，對于熱射病在炎性反應方面的病理學機制研究有重要意義。進一步通過對巨噬細胞極化的某些關鍵通路、影響因素等加以干預處理，改變巨噬細胞極化方向，為提高熱射病的治愈率、降低病死率，提供新的治療策略。