何濤,胡洪,謝楠,錢程,李春滿,唐波,付必莽,李文

(1玉溪市人民醫(yī)院，云南玉溪 653100;2昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)

肝癌惡性程度極高，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，即使手術根治性切除，多數(shù)患者5年生存率仍不足20%[1]。新型共刺激分子B7-H4是近年新發(fā)現(xiàn)的一種負性共刺激分子，參與腫瘤發(fā)生的多個過程，如細胞周期、增殖、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在正常組織中呈低表達或不表達，而在部分腫瘤中呈高表達[1～3]。2018年3～5月，首先我們篩選出高表達B7-H4的肝癌細胞株,并進行慢病毒的轉染抑制，抑制肝癌細胞株B7-H4的表達量，以期觀察體外抑制該基因后對肝癌細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3購自中科院昆明細胞庫。PBS(20×PBS Buffer)、TBS(20×TBS Buffer)購自上海生工生物工程有限公司。細胞裂解液及胰酶消化液購自上海翊圣生物科技有限公司。DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、蛋白定量試劑盒、二抗、ECL發(fā)光液及GAPDH單克隆抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。聚凝胺(Polybrene)購自吉滿生物科技(上海)有限公司。慢病毒(Lentivirus)載體設計合成與驗證均由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。目的基因shRNA-1序列:5′-GGATATCAAAGTGACAGAATC-3′，shRNA-2序列:5′-GGAAGTGAATGTGGACTATAA-3′。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒，CCK-8試劑盒購自江蘇凱基生物科技公司。B7-H4兔抗單克隆抗體購自美國Abcam公司及北京博奧森生物技術有限公司。多功能酶標儀、ECL成像系統(tǒng)由Bio-Rad Laboratories科技公司提供。流式細胞儀由美國BD公司提供，型號為FACSCalibur型。

1.2 肝癌細胞培養(yǎng)、篩選及基因沉默 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7三種細胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基、10% FBS培養(yǎng)，PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3三種細胞用DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS培養(yǎng)，以上細胞均置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基中加青-鏈霉素雙抗。待細胞處于對數(shù)生長期且細胞融合達70%～80%時，收取細胞蛋白，使用Western blotting法篩選出高表達B7-H4的細胞株。將該細胞株使用上述方法，改用24孔板中培養(yǎng)，待細胞密度合適時，行慢病毒轉染。將所培養(yǎng)的細胞隨機分為三組：對照組、shRNA-1組、shRNA-2組。培養(yǎng)并觀察細胞的生長情況，待細胞長至對數(shù)期且狀態(tài)良好，各組細胞融合率達75%時，行轉染操作。其中，shRNA-1組、shRNA-2組分別轉染對應的B7-H4慢病毒抑制基因序列，對照組加轉染試劑但不予干擾序列。具體細胞培養(yǎng)轉染過程如下：①培養(yǎng)細胞并調(diào)整好細胞狀態(tài)，慢病毒轉染前一夜，將各肝癌貼壁細胞進行細胞計數(shù)并以1×105/孔鋪到24孔板中培養(yǎng)，并使各肝癌細胞在轉染時的總量控制在2×105/孔。②慢病毒轉染時，先配制Polybrene試液，將原培養(yǎng)基用含有6 μg/mL Polybrene的新配培養(yǎng)基替換，并加入目標基因病毒懸液，繼續(xù)培養(yǎng)。③4～6 h后，再加入1 mL新鮮培養(yǎng)基以稀釋轉染體系。④繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，用新鮮培養(yǎng)基完全替代含有慢病毒液的培養(yǎng)基。⑤轉染48 h后，進行熒光檢測(綠色熒光蛋白)，通常該熒光在72 h時最明顯。我們使用并收集轉染72 h時的各肝癌細胞行后續(xù)實驗。

1.3 慢病毒沉默B7-H4表達效率的檢測 采用Western blotting法。取各組轉染72 h細胞，刮取并裂解細胞提取蛋白，進行蛋白定量測定。按照4∶1的比例取適量蛋白液和蛋白上樣緩沖液混勻，沸水加熱約10 min使蛋白變性。按目的蛋白分子大小配制WB膠版,并上樣目的蛋白液，每孔約30 μg，按110 V恒壓電泳、220 mA恒流條件轉膜，轉膜時間約100 min。然后將已經(jīng)轉好的PVDF膜置于TBS-T緩沖液中漂洗約10 s，適宜比例條件下的脫脂牛奶封閉上述膜1 h備用，再孵育B7-H4抗體和內(nèi)參抗體，4 ℃條件下孵育過夜。第2天TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，TBS-T緩沖液洗膜1次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，再次按上述方式洗膜，曝光條帶并分析實驗結果，觀察轉染慢病毒抑制后的各組目的蛋白表達情況，經(jīng)過實驗，挑選出shRNA-2組HCCLM3肝癌細胞進行下一步實驗。

1.4 慢病毒抑制B7-H4基因對HCCLM3肝癌細胞增殖能力的影響 采用CCK-8法。取上述轉染72 h 細胞，按不低于1 000/孔接種在96孔板中培養(yǎng)，同時每組設3個復孔。按設定時間每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，然后在480 nm處測定各孔光密度(OD)值。并以實驗測定結果繪制細胞增殖曲線，統(tǒng)計分析目的基因抑制后細胞增殖能力的變化。

1.5 慢病毒抑制B7-H4基因對HCCLM3肝癌細胞凋亡率的影響 肝癌細胞HCCLM3經(jīng)慢病毒轉染抑制1、2、3、4、5 d后，用胰酶消化液消化細胞(不含EDTA)，溫和吹打并收集細胞，確保細胞總量不低于10 000個，再用事先預冷的PBS洗滌上述細胞2～3次。按照凋亡試劑盒說明分次分組加入結合緩沖液、Annexin-V，再加入PI染液重懸細胞，室溫避光孵育10～30 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，并采用流式分析軟件FloMax 2.82版本分析實驗所得結果。

2 結果

2.1 各組肝癌細胞B7-H4的相對表達量比較 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3細胞的B7-H4表達量見圖1，可見6個細胞株中，HCCLM3的B7-H4相對表達量最高，為高表達B7-H4細胞株。

2.2 慢病毒轉染后HCCLM3細胞B7-H4的表達情況 shRNA-1組、shRNA-2組B7-H4被抑制，且shRNA-2組抑制更明顯。見圖2。

圖1 不同肝癌細胞系中B7-H4表達

圖2 慢病毒轉染后HCCLM3細胞B7-H4表達

2.3 抑制B7-H4表達對HCCLM3細胞增殖活性的影響 與對照組同時間比較，除轉染1 d細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義外，shRNA-2組HCCLM3細胞增殖活性降低(P均<0.05)。見表1。

2.4 抑制B7-H4表達對HCCLM3細胞凋亡的影響 轉染后72 h，對照組凋亡率為9.63%，shRNA-2組凋亡率為43.3%，兩組比較，P<0.01。

表1 兩組細胞增殖活性比較

注:與對照組同時間點比較，*P<0．05，**P<0．01。

3 討論

B7-H4是B7家族最新的新型共刺激分子，相對分子質(zhì)量約為31 kD，定位于細胞質(zhì)及細胞膜，以往研究多關注其在免疫過程中的效應。該分子在正常組織中不表達或低表達，在多個惡性腫瘤組織中呈高表達。研究發(fā)現(xiàn)，肝、腎、肺等器官B7-H4蛋白不表達，但可檢測到相關mRNA的表達[1,2,4]。我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，該蛋白在肝內(nèi)膽管癌、肝癌及結直腸癌等腫瘤中高表達，與多個相關研究[2]結果相符。通過多項基于該蛋白的研究，可表明機體對B7-H4基因的調(diào)控極有可能發(fā)生在翻譯水平。與此同時，B7-H4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性表型以及腫瘤免疫密切相關[4]。

B7-H4調(diào)節(jié)細胞增殖及細胞凋亡與多個細胞凋亡相關信號分子及通路有關，我們在B7-H4與肝內(nèi)膽管癌關系的研究中發(fā)現(xiàn)，B7-H4與肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病密切相關，高表達的B7-H4可以促進腫瘤的發(fā)生，且促進腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉化(EMT)，促進了細胞的侵襲轉移，同時抑制肝內(nèi)膽管癌細胞的凋亡。該過程的發(fā)生可能與Bcl-2/Bax比例失調(diào)有關，最終促使Caspase-3改變[2]。Qian等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因的表達，可增加細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達，同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，通過調(diào)節(jié)兩者的蛋白表達量及比例最終使Caspase-3、Caspase-9激活，并促進細胞凋亡發(fā)生。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因后，可使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2erk等的激活，并促進腫瘤細胞凋亡[2,5]，與本研究結果相似。此外，在高表達B7-H4的非腫瘤細胞中，該基因的過表達可阻斷Fas/FasL信號通路途徑抑制相關細胞的凋亡[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4與腫瘤細胞的增殖關系密切，過表達該基因可增強腫瘤細胞的增殖能力。Zhang等[7]研究認為，B7-H4可存在于細胞的多個部位，在細胞增殖過程中，可發(fā)生質(zhì)-核穿梭過程。多數(shù)研究者認為，其基因內(nèi)包含核定位序列，同時該研究者也發(fā)現(xiàn)，進入細胞核內(nèi)部的B7-H4可影響細胞周期相關蛋白Cyclin E/D1的表達，而兩者表達量的變化及相對比例影響細胞周期G/S期的轉變，并最終促進腫瘤細胞增殖。Jeon等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將B7-H4轉染到人結腸癌SW-620及RKO細胞中，可發(fā)現(xiàn)上述兩種癌細胞的增殖速率明顯加快，且在裸鼠皮下荷瘤過程中，可發(fā)現(xiàn)過表達該基因的裸鼠具有明顯的生長優(yōu)勢。Cui等[9]用As2O3抑制肝細胞癌B7-H4的表達中，發(fā)現(xiàn)該基因被抑制后，JAK2/STAT3信號通路即可被抑制，并最終影響肝癌細胞的生長。另外，也有文獻報道，B7-H4可通過誘導缺氧誘導因子的激活促進腫瘤細胞增殖和惡性進展。同時，該研究指出高表達B7-H4促進上皮細胞的惡性轉變，加速了腫瘤細胞的增殖[8]。

B7-H4過表達不僅可促使腫瘤細胞增殖，同時還可增強腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。在肝內(nèi)膽管癌及結直腸癌中，我們應用慢病毒抑制技術過表達及抑制該基因的表達，可發(fā)現(xiàn)相關腫瘤細胞侵襲及轉移能力的改變。同時也證明了結直腸癌上皮細胞的EMT轉化可能是PI3K/AKT通路激活所致[2,10～13]。部分研究者使用B7-H4-RNAi轉染人結直腸癌LOVO細胞株后發(fā)現(xiàn)，CXCL-12趨化因子受體CXCR-4和JAK2/STAT3 mRNA的轉錄及相關蛋白表達水平明顯下調(diào)，且其細胞侵襲能力下降[10]。該研究指出，B7-H4可通過調(diào)控上述細胞信號通路，并最終增強腫瘤細胞侵襲能力的轉變。我們在研究中亦發(fā)現(xiàn)，剔除裸鼠B7-H4基因可顯著抑制裸鼠肝內(nèi)肝癌細胞的肺轉移傾向[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，抑制B7-H4后，HCCLM3肝癌細胞凋亡率增加，而腫瘤細胞的低凋亡率是其惡性程度的最大體現(xiàn)，同時腫瘤細胞的增殖在目的基因被抑制后明顯降低。我們在實驗中，亦發(fā)現(xiàn)shRNA-2組抑制B7-H4表達效率較好，抑制效果更加明顯，同時觀察分析shRNA-1組，可能有脫靶效應的干擾。

綜上所述，慢病毒抑制HCCLM3肝癌細胞B7-H4表達可抑制該細胞增殖活性，加速該細胞凋亡，有望成為肝癌潛在的治療靶點及治療藥物研發(fā)新方向。