李波翰，趙乾，劉斌，高春正，吳東進(jìn)，趙延英，潘霄瀚，張穎哲

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033；2山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院；3日本和歌山縣立醫(yī)科大學(xué))

骨不連與骨缺損為骨折愈合過程中較難解決的并發(fā)癥之一。組織工程為治療該疾病提供了理想途徑，展現(xiàn)出良好的前景。間充質(zhì)干細(xì)胞因多效性、旁分泌作用和免疫調(diào)節(jié)特性而成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的理想干細(xì)胞候選體。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)在韌帶骨化過程中起重要作用[1]。韌帶主要為成纖維細(xì)胞，體外實驗應(yīng)用BMP-2是否能成功誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可為韌帶骨化進(jìn)程提供相關(guān)實驗依據(jù)。新生小鼠成纖維細(xì)胞能夠自我復(fù)制，也在理論上具有多向分化的潛力[2]，將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化，并能有效表達(dá)BMP-2,則可考慮應(yīng)用成纖維細(xì)胞代替間充質(zhì)干細(xì)胞，作為治療骨不連與骨缺損的種子細(xì)胞之一[3]。2017年10月～2018年3月，本研究探討了BMP-2體外誘導(dǎo)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:清潔級新生3 d小鼠(不分雌雄)3只，體質(zhì)量1～2 g，昆明種，購自山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院動物中心。主要試劑與儀器:DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液均購自美國Hyclone公司，雙抗(青霉素與鏈霉素)購自山東大學(xué)第二醫(yī)院，茜素紅S購自Sigma-Aldrich公司，BMP-2、BMP-2兔抗鼠抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 每100 mL細(xì)胞培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基90 mL和10%胎牛血清10 mL組成，培養(yǎng)液內(nèi)再加入適量1%雙抗溶液。取新生3 d小鼠，應(yīng)用脊椎脫臼法處死，75%乙醇消毒，剪下小鼠背部皮膚，去除皮下組織，將皮膚剪成大小約2 mm×2 mm的組織塊，然后放入培養(yǎng)皿中，滴加配制完成的細(xì)胞培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液剛沒過組織塊。然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo) 將BMP-2加入配制完成的細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度至50 μg/L。將培養(yǎng)至第4代的成纖維細(xì)胞，加入含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液[4]。培養(yǎng)12 d，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，應(yīng)用反復(fù)貼壁法[5]純化成骨細(xì)胞。

1.4 成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的鑒定 ①細(xì)胞形態(tài)觀察：定期觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。②鈣結(jié)節(jié)檢測：采用茜素紅染色，茜素紅可與鈣鹽結(jié)合生成復(fù)合物，鈣結(jié)節(jié)被染色呈深橘紅色。含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)6、8、10、12 d進(jìn)行茜素紅染色。吸出培養(yǎng)液，用PBS浸洗，用75%乙醇室溫下固定1 h，再次用PBS浸洗，茜素紅溶液室溫下染色20 min，用PBS沖洗多余的染色劑，置于顯微鏡下觀察，并用Image J進(jìn)行半定量分析。③BMP-2表達(dá)檢測：采用免疫熒光法，將成纖維細(xì)胞以及誘導(dǎo)后12 d的成纖維細(xì)胞分別接種于載有玻片的12孔板上，每孔約1 mL。PBS浸洗，4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片15 min，PBS浸洗，0.5% Triton X-100破膜，PBS浸洗，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min，每張玻片滴加一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜，第2天加熒光二抗,避光孵育，PBST浸洗，濕盒中孵育1 h，PBST浸洗,滴加DAPI對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST浸洗，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察，2 d即有細(xì)胞從組織塊邊緣游出，并以組織塊為中心呈放射狀排列。細(xì)胞形態(tài)呈梭形，細(xì)胞核顯示清晰呈圓形或橢圓形，偶見少量扁平多角上皮樣細(xì)胞存在，但逐漸消失。加入含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液后，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多角形等多種形態(tài)，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，可見多個黑色顆粒樣物質(zhì)沉積于胞質(zhì)內(nèi)。見圖1、2。

2.2 鈣結(jié)節(jié)檢測 含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d后茜素紅染色可見極少量被染成深橘紅色的結(jié)節(jié)樣物質(zhì)；培養(yǎng)8、10 d后，茜素紅染色被染成深橘紅色的結(jié)節(jié)樣物質(zhì)逐漸增多；含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d，茜素紅染色可見大量被染成深橘紅色的結(jié)節(jié)樣物質(zhì)。見圖3。含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d后茜素紅染色測定染色面積比例為0.30%；培養(yǎng)8 d后染色面積比例為0.75%；培養(yǎng)10 d后染色面積比例為2.42%；培養(yǎng)12 d后染色面積比例為17.61%。培養(yǎng)12 d后，茜素紅染色面積與其他三個時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 BMP-2表達(dá)檢測 未用含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞免疫熒光檢測，未發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光的陽性細(xì)胞，藍(lán)色為被DAPI染色的細(xì)胞核。見圖4。應(yīng)用含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d后的成纖維細(xì)胞免疫熒光檢測，可見大量含有綠色熒光的陽性細(xì)胞，藍(lán)色為被DAPI染色的細(xì)胞核。見圖5。

圖1 培養(yǎng)2 d即有大量細(xì)胞自組織塊游出(×100)

圖2 加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

注:a為含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d茜素紅染色結(jié)果；b為培養(yǎng)8 d茜素紅染色結(jié)果；c為培養(yǎng)10 d茜素紅染色結(jié)果；d為培養(yǎng)12 d茜素紅染色結(jié)果。

圖3茜素紅染色結(jié)果(×40)

注:未發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光的陽性細(xì)胞。

圖4未用含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(×200)

注:可見大量含有綠色熒光的陽性細(xì)胞。

圖5用含有BMP-2的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(×200)

3 討論

隨著年齡增長，越來越多人群出現(xiàn)脊柱韌帶骨化現(xiàn)象，并長期飽受疾病痛苦。韌帶骨化的機(jī)制仍不十分明確。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，脊柱韌帶骨化是基因與內(nèi)、外環(huán)境共同作用的結(jié)果[6]。經(jīng)過大量實驗研究表明，BMP在體內(nèi)成骨過程中扮演重要角色[7]。因此通過研究新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化的可能性，模擬韌帶成纖維細(xì)胞骨化的過程。本研究結(jié)果也表明，在一定濃度的外源性BMP環(huán)境中，隨著時間遷移，新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力。茜素紅染色半定量分析結(jié)果顯示，含有BMP-2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d后茜素紅染色面積與6 d、8 d、10 d的染色面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光結(jié)果顯示，誘導(dǎo)12 d的成纖維細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯BMP-2表達(dá)，而正常成纖維細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)有明顯BMP-2表達(dá)。研究結(jié)果表明，應(yīng)用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)12 d后成纖維細(xì)胞具有良好的成骨細(xì)胞能力。由此脊柱韌帶骨化的可能機(jī)制為：韌帶組織附著于骨質(zhì)上，各種因素導(dǎo)致脊柱退行性變，出現(xiàn)骨質(zhì)增生，局部環(huán)境的BMP含量增加。對于附著骨質(zhì)的韌帶而言，即外源性BMP增加，而且韌帶受到局部機(jī)械刺激增加，可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞逐漸向成骨細(xì)胞分化。已經(jīng)骨化的成纖維細(xì)胞又可作為BMP的來源，引起周圍韌帶成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，慢慢演變?yōu)槟骋还?jié)段韌帶完全骨化，并引起相應(yīng)癥狀。

骨折為骨科常見疾病，BMP-2在骨折愈合過程中對骨形成具有重要作用[8]。有研究表明，BMP-2作為骨折患者手術(shù)干預(yù)的補(bǔ)充可有效地促進(jìn)骨折愈合、降低感染率[9，10]。創(chuàng)傷性骨折后，尤其局部軟組織損傷嚴(yán)重者，骨折斷端周圍組織血供受到破壞，骨折愈合過程中所需物質(zhì)的供應(yīng)減少，造成骨折延遲愈合或是不愈合，即形成骨不連甚至骨缺損，為骨折研究領(lǐng)域較難課題。骨組織工程學(xué)的出現(xiàn)，為治療骨不連或是骨缺損提供了良好的發(fā)展前景。研究表明，多種細(xì)胞均可作為骨組織工程的種子細(xì)胞，向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并有效表達(dá)BMP-2。但有些細(xì)胞培養(yǎng)成本較高，取材較為困難。找到存在廣泛并具備向成骨細(xì)胞分化能力的細(xì)胞是本次研究的主要方向。成纖維細(xì)胞在體內(nèi)廣泛存在，尤其皮膚含有大量成纖維細(xì)胞;而且該細(xì)胞易于培養(yǎng)，成本較低。有研究表明，韌帶成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞均具備向成骨細(xì)胞分化的能力[11，12]。牙齦成纖維細(xì)胞容易被采集，培養(yǎng)成活率較高，經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后能夠表達(dá)BMP-2,但是牙齦成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力較弱，不能十分高效地表達(dá)BMP，對影響骨代謝的細(xì)胞因子反應(yīng)性較差[13，14]。本研究從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中加入成骨誘導(dǎo)液后，細(xì)胞具備成骨細(xì)胞形態(tài)。鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色以及免疫熒光檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備成骨細(xì)胞生物學(xué)特征，能夠有效表達(dá)BMP-2并分泌相關(guān)物質(zhì)形成礦化結(jié)節(jié)。因此皮膚成纖維細(xì)胞也具備向成骨細(xì)胞分化的能力，由于存在廣泛易于培養(yǎng)，可考慮將皮膚成纖維細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞之一研究骨不連或是骨缺損的治療。本次實驗僅研究在BMP外環(huán)境因素誘導(dǎo)下皮膚成纖維細(xì)胞成功向成骨細(xì)胞分化并檢測BMP-2定性表達(dá)，未研究細(xì)胞成骨分化后BMP-2的定量表達(dá)、BMP誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的具體機(jī)制以及是否有其他重要細(xì)胞因子參與，這些問題尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力，皮膚成纖維細(xì)胞有可能作為骨組織工程的種子細(xì)胞修復(fù)骨不連或骨缺損。