郭帥，李艷

（1.晉中學(xué)院，山西榆次030619；2.山西師范大學(xué)食品學(xué)院，山西臨汾041004；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌571339）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明人體的許多疾病與體內(nèi)自由基的失衡密切相關(guān)[1-2]。機(jī)體內(nèi)過量的羥基自由基、超氧根離子自由基可進(jìn)一步引發(fā)多種化學(xué)反應(yīng)，生成一系列化學(xué)物質(zhì)，從而使人體自由基失衡，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[3]。同時(shí)，自由基引發(fā)的氧化-還原反應(yīng)失衡也是導(dǎo)致食品品質(zhì)下降、腐敗變質(zhì)的重要因素。因而，控制機(jī)體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生十分關(guān)鍵?？寡趸瘎┦悄軌蛴行宄杂苫奈镔|(zhì)，在食品工業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛。目前常用的抗氧化劑多為化學(xué)合成類抗氧化劑，但因安全性問題其使用量和使用范圍受到越來越嚴(yán)格的限制。因此，尋找安全、高效、無毒的天然抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)。谷蛋白-1（glutelin-1）是蛋白質(zhì)家族中較為特殊的一員，它是溶解于稀酸溶液中的一類蛋白質(zhì)的總稱[4]。大多數(shù)植物蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH3.0～5.0，在等電點(diǎn)附近，大多數(shù)植物蛋白溶液的靜電荷為零，溶解度最低；而谷蛋白-1的等電點(diǎn)較高，在此pH范圍內(nèi)的溶解度較好，因而在食品工業(yè)尤其是酸性食品中有潛在的用途。前期的研究表明，椰子蛋白中含14.4%的谷蛋白-1，脫脂椰麩谷蛋白-1能夠有效降低小鼠的血清膽固醇，具有抗氧化的潛力[5-6]。椰麩（coconut cake）是椰肉榨汁后的副產(chǎn)物，含有8%～16%的蛋白質(zhì)，是豐富的植物蛋白質(zhì)資源[7]。然而，目前椰麩僅僅被用作動(dòng)物飼料或蛋糕等食品的輔料，蛋白質(zhì)等活性成分沒有被開發(fā)利用，造成了資源的極大浪費(fèi)。本試驗(yàn)以脫脂椰麩為原料制備谷蛋白-1，研究脫脂椰麩谷蛋白-1的抗氧化性，以期為椰麩的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰麩：南椰食品科技有限公司；三氯乙酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸鈉、冰乙酸、三氯化鐵：天津科密歐公司；2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、Ferrozine試劑、沒食子酸：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IFFM-E）：香港BUCHI公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（PYX-DHG-9101-25A）：廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；磁力攪拌器（JB-3）：上海智光儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1200）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（D-78532）：德國Httch公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂椰麩的制備

椰麩→50℃、鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h→粉碎→過60目篩→加入石油醚（料液比=1∶10，g/mL）→振蕩脫脂2 h→過濾→棄濾液→重復(fù)脫脂3～4次→脫脂椰麩

1.3.2 脫脂椰麩谷蛋白-1的制備

參照Kwon等[8]的方法，50 g脫脂椰麩中加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，4℃下攪拌提取 8 h，棄去過濾，收集濾渣。在濾渣中再次加入300 mL、0.4 mol/L NaCl，如此重復(fù)提取3次，棄去濾液，以除去椰子清蛋白和球蛋白。收集濾渣，加入50%冰乙酸，4℃下攪拌提取8 h，重復(fù)提取3次，合并提取液。然后在4℃、10 000 g下離心30 min，收集上清液，裝入截留分子量為4 000 Da的透析膜中，4℃下、在dH2O中透析24 h，每隔2小時(shí)換一次dH2O，將透析液冷凍干燥后即得到脫脂椰麩谷蛋白-1（defatted coconut cake glutelin-1，DCCG-1）。脫脂椰麩中蛋白質(zhì)含量用微量凱氏定氮儀法測(cè)定（N×6.25），而提取液中蛋白質(zhì)含量按照Bradford法[9]進(jìn)行。

1.3.3 氨基酸組成分析

參照Wang等[10]的方法，在0.1 g DCCG-1中加入5 mL、6 mol/L的鹽酸中，110℃下水解24 h。用0.45 μm的膜過濾水解液，收集濾液，在HITACHI L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀上測(cè)定。

1.3.4 DCCG-1對(duì)超氧根離子自由基的清除作用

將按照1.2.2制備的DCCG-1復(fù)溶于0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液（pH2.0）中，分別配制成50 μg/mL～250 μg/mL的溶液，用于抗氧化試驗(yàn)。

參照文獻(xiàn)[11]的方法：取DCCG-1溶液0.1 mL，加入到3 mL、3 mmol/L的鄰苯三酚溶液中，混合均勻后，在320 nm下比色，每隔30秒記錄一次吸光值，共記錄10 min。模型管用dH2O代替樣品，以BHT做對(duì)照。

超氧根離子的清除率/%=（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品管的吸光值，A模型為模型管的吸光值。

1.3.5 對(duì)ABTS+·的清除作用

參照文獻(xiàn)[12]的方法：將20 μL DCCG-1溶液與2 mL ABTS溶液（7 mmol/L）混合均勻，30℃下暗反應(yīng)6 min，然后在734 nm下比色。模型管用dH2O代替樣品，以BHT做對(duì)照。

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵?，A空白為空白管的吸光值。

1.3.6 對(duì)羥基自由基的清除作用

參照文獻(xiàn)[13]的方法：在1.34 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.4）中依次加入28 mmo1/L的脫氧核糖溶液0.3 mL，28 mmol/L的雙氧水0.3 mL，2.5 mmol/L的三氯化鐵溶液30 μL，l mmol/L的EDTA-Na20.3 mL以及0.1 mL、100 μg/mL的DCCG-1溶液。然后添加30 μL、10 mmol/L 抗壞血酸引發(fā)反應(yīng)，37℃水浴 1 h，加入0.3 mL硫代巴比妥酸溶液（1%），30 μL三氯乙酸（28%），100℃，水浴20 min，冷卻后532 nm下測(cè)吸光值。模型管用dH2O代替樣品。以BHT作對(duì)照。

羥基自由基的清除率/%=（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵担珹模型為模型管的吸光值。

1.3.7 Fe2+絡(luò)合能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]的方法：移取50 μL、不同濃度的DCCG-1 溶液（50 μg/mL～250 μg/mL）于試管中，加入1 mmol/L 的 FeSO4溶液 25 μL，5 mmol/L 的 Ferrozine試劑50 μL，室溫反應(yīng)10 min后，用甲醇定容到3 mL，在562 nm下測(cè)吸光值。模型管用甲醇代替樣品，用BHT作對(duì)照。

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵?，A模型為模型管的吸光值。

1.3.8 還原能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]的方法：移取200 μL的DCCG-1溶液于試管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6），1 mL鐵氰化鉀溶液（1%），混合后于50℃水浴加熱20 min，然后加入10%的三氯乙酸1 mL，4 000 r/min常溫離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL dH2O以及400 μL三氯化鐵（1 g/L），混勻后在700 nm測(cè)吸光值，用BHT作對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成

DCCG-1的氨基酸組成與含量如表1所示。

表1 脫脂椰麩谷蛋白-1的氨基酸組成和含量Table 1 Composition and content of amino acid in DCCG-1 g/100 g蛋白質(zhì)

從表1可以看出，DCCG-1含有16種氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸的含量都較高。8種必需氨基酸中，色氨酸的含量很低，為第一限制性氨基酸。但DCCG-1中亮氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸的含量以及必需氨基酸總和（total of essential amino acids，TEAA）均顯著高于FAO/WHO[15]的推薦值（12.7 g/100 g蛋白質(zhì)），表明DCCG-1的氨基酸組成相對(duì)合理。值得注意的是，DCCG-1中精氨酸、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸）的含量較高，但缺乏半胱氨酸。研究表明，蛋白質(zhì)或多肽鏈中這幾類氨基酸的含量與蛋白質(zhì)或多肽的抗氧化性密切相關(guān)[11-14，16]。例如，芳香族氨基酸中苯環(huán)上的酚羥基可以快速給出質(zhì)子，有效清除自由基[14]；而含硫氨基酸中的二硫鍵或巰基與蛋白質(zhì)的金屬離子絡(luò)合能力密切相關(guān)[13-14，17]。

2.2 DCCG-1的抗氧化能力

2.2.1 DCCG-1對(duì)超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力

O2-·是機(jī)體受損或代謝失衡時(shí)最先產(chǎn)生的自由基之一。O2-·會(huì)引發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生更多的自由基，引發(fā)氧化反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生，直至對(duì)機(jī)體細(xì)胞或器官造成損傷。因而O2-·既是機(jī)體氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，也是許多氧化反應(yīng)的引發(fā)物和底物[12，18]。O2-·清除能力已經(jīng)成為衡量抗氧化劑活性的重要指標(biāo)之一。DCCG-1對(duì)超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力見圖1。

圖1 DCCG-1對(duì)O2-·的清除能力Fig.1 Scavening activity of DCCG-1 on O2-·

結(jié)果表明，與BHT相比DCCG-1具有更高的O2-·清除能力，這可能與DCCG-1中大量的苯丙氨酸和酪氨酸有關(guān)（表1所示），苯丙氨酸和酪氨酸所含的酚羥基可以提供質(zhì)子而作為還原劑，有效猝滅O2-·，從而阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生[14]。同時(shí)，隨著濃度的提高，DCCG-1的清除能力也提高。

2.2.2 DCCG-1對(duì)ABTS+·的清除能力

ABTS+·被廣泛應(yīng)用于測(cè)定抗氧化劑的總抗氧化能力了。圖2顯示了DCCG-1在不同濃度下對(duì)ABTS+·的清除能力。

圖2 DCCG-1對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.2 Scavening activity of DCCG-1 on ABTS+·

結(jié)果表明，隨著DCCG-1濃度的升高，其ABTS+·清除能力也逐漸變大。且在被測(cè)的濃度范圍內(nèi)，DCCG-1對(duì)ABTS+·的清除能力顯著大于BHT。這可能與其氨基酸組成有關(guān)。如表1所示，DCCG-1中精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及支鏈氨基酸的含量都較高，尤其是精氨酸。這些氨基酸所含的一些基團(tuán)，如胍基、酚羥基、支鏈氨基等，均可以提供質(zhì)子，有效清除過量的游離自由基，阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生。BHT是工業(yè)中最常用的抗氧化劑和自由基清除劑。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，DCCG-1具有較高的總抗氧化能力。可以利用這一性質(zhì)，將DCCG-1添加到肉湯、火腿等食品中，提高產(chǎn)品的貨架期。

2.2.3 DCCG-1對(duì)羥基自由基的清除能力

·OH是已知的活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)的一種自由基，它可以通過多種反應(yīng)破壞生物體的各種大分子，如蛋白質(zhì)、脂肪和DNA，特別是維生素B1和鳥嘌呤核苷[18]，對(duì)生物體造成很大程度的損傷。DCCG-1對(duì)·OH的清除能力見圖3。

圖3 DCCG-1對(duì)·OH的清除能力Fig.3 Scavening activity of DCCG-1 on·OH

如圖3所示，隨著濃度的增大，DCCG-1對(duì)·OH的清除能力逐漸升高。DCCG-1的·OH清除能力要顯著低于BHT。然而，200 μg/mL的DCCG-1對(duì)·OH的清除能力（20.48%）要顯著高于油棕粕谷蛋白-1（12.14%）[13]和米糠蛋白的清除能力（7.42%）[16]，這表明DCCG-1具有一定的·OH清除能力。

2.4 DCCG-1對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力

在生物體內(nèi)，F(xiàn)e2+不僅可催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還能與活性氧反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，從而破壞生物體的生物大分子，生物體的抗氧化劑能夠絡(luò)合二價(jià)鐵離子而降低其損害。DCCG-1對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力見圖4。

圖4 DCCG-1對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力Fig.4 Chelating ability of DCCG-1 on Fe2+

如圖4所示，在 50 μg/mL～250 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，DCCG-1對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力顯著低于BHT。這可能與其缺乏含硫氨基酸有關(guān)。研究表明，蛋白質(zhì)中的巰基或二硫鍵可以有效絡(luò)合Pb2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子，這類蛋白質(zhì)既可以作為有效的抗氧化劑，也可以用作重金屬解毒劑[19]。

2.5 DCCG-1的還原力

DCCG-1的還原力見圖5。

圖5 DCCG-1的還原力Fig.5 Reducing power of DCCG-1

在700 nm下的吸光值越高，表明該抗氧化劑的還原力越高，抗氧化性越強(qiáng)。如圖5所示，DCCG-1的還原力顯著高于BHT，且隨濃度的增大DCCG-1的還原力也逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，DCCG-1對(duì)超氧根離子自由基和ABTS+自由基具有較強(qiáng)的清除能力；同時(shí)表現(xiàn)出較高的還原力和一定的羥基自由基清除能力和Fe2+絡(luò)合能力，這表明DCCG-1具有較強(qiáng)的抗氧化性；同時(shí)，由于脫脂椰麩的產(chǎn)量巨大，來源豐富，價(jià)格低廉，DCCG-1的制備工藝也相對(duì)簡(jiǎn)單，因而DCCG-1具有開發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。然而，大分子蛋白無法進(jìn)入血液循環(huán)中直接發(fā)揮抗氧化活性；一些大分子蛋白被攝入后，容易被人體胃腸道消化系統(tǒng)中的酶降解，或生成多個(gè)無生物活性的肽段，或生成生物活性更強(qiáng)的肽段。因此，DCCG-1在體內(nèi)是否具有抗氧化活性，還需要進(jìn)一步的研究。