邵冬冬，陳千，李赫宇，肖文平，3，*

（1.黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，催化材料與制備湖北省重點實驗室，湖北黃岡438000；2.天津益倍生物科技集團，天津300457；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

昆侖雪菊是維吾爾族人民傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健的天然植物，當(dāng)?shù)厝朔Q其為“古麗恰爾”。由于其生長環(huán)境較少污染，富含多種對人體有益的成分，故現(xiàn)今已逐漸作為一種茶飲普及開來。雪菊，學(xué)名兩色金雞菊（Coreopsis Tinctoria）蛇目菊，為菊科金雞菊屬（Coreopsis）多年生草本植物，在我國新疆尤其是和田地區(qū)、云南部分地區(qū)有一定規(guī)模栽培。目前雪菊的提取方法主要有水提法，醇提法，醇水混合提取，微波及超聲波提取及超臨界二氧化碳提取等。其主要的化學(xué)成分有酮、有機酸、萜烯、多糖等，迄今已報導(dǎo)的雪菊活性主要包括抗炎、降脂、降壓、降糖、抗凝血、抗氧化、抗病毒等[1-9]。國內(nèi)外很多學(xué)者研究雪菊，但大部分是關(guān)于含量測定和生物活性的，而關(guān)于雪菊粗提物的分離和雪菊中化合物的結(jié)構(gòu)研究報道較少[10-21]。

抗氧化物質(zhì)與人們的生產(chǎn)和生活密不可分，疾病治療、食品加工、生活用品中都可能會用到。研究來源無害、不造成環(huán)境污染的天然抗氧化物質(zhì)—植物源抗氧化劑成為了近年來食品界研究的熱點。雪菊作為一種新型的植物抗氧化劑原料越來越受到重視，由于其產(chǎn)量在新疆地區(qū)豐富，在該地區(qū)分布廣泛，其揮發(fā)油、有機酸和黃酮產(chǎn)量豐富，具有抑菌和抗氧化、促生長等作用而成為需要大力開發(fā)的資源[6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

昆侖雪菊：江西致和堂中藥飲片有限公司。

所有試劑均為市售分析純。

UV-3802型紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DG-120型四兩裝中藥材粉碎機：浙江省瑞安市春海藥材器械廠。

1.2 石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的制備

參考文獻方法[22]，取雪菊30 g，粉粹至10目左右，每次加入75%的乙醇400 mL[9]，90℃加熱回流提取3次，回流時間分別是1 h、1 h、40 min。放冷，合并3次提取液進行減壓抽濾，濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味。濃縮液分別用與其體積比為1∶1的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別回收至干燥，得到石油醚部位76.9 mg、氯仿部位677.2 mg、乙酸乙酯部位498.4 mg、正丁醇部位 2 747.3 mg。

1.3 抗氧化活性的測定[23]

1.3.1 不同溶劑提取物對DPPH自由基清除率

將1.2中得到的石油醚部位用75%的乙醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中，用移液槍取5mL上述溶液，用75%的乙醇定容至10 mL，此為待測液。稱取5 mg DPPH，用75%的乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中，避光備用。將2 mL待測液及2 mL DPPH溶液置于一具塞試管中，搖勻，放置30 min，以75%乙醇加DPPH溶液為空白，以待測液加75%乙醇為對照，于517 nm處測定吸光度，并以下式計算清除率。

以同樣的方法測定氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的清除率。另取70 mgVC加75%的乙醇定容至50 mL，用移液槍取上述溶液5 mL，用75%的乙醇定容至10 mL，測定清除率。

1.3.2 雪菊各提取部位清除·OH的能力的測定

分別取1.2中的提取物25 mg，用乙醇定容至25 mL。在10mL試管中分別加入6mmol/L的FeSO4溶液1 mL，分別加入上述溶液1.0 mL，再加6 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，搖勻，放置10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸溶液3 mL，搖勻，37℃恒溫反應(yīng)30 min，于510 nm處測吸光度，空白試劑代替樣品為空白組，以空白試劑代替水楊酸為對照組，VC為陽性對照，每個樣品重復(fù)3次，取平均值。按以下公式計算各提取部位的清除率。

式中：Ac為空白組吸光度；Ai為待測樣品的吸光度；Aj為對照組吸光度。

1.3.3 總還原能力的測定

采用鐵離子還原能力測定法測定1.2中各種提取物的總還原能力。分別取1.2中的提取物25 mg，用乙醇定容至25 mL，用移液槍取10 mL上述溶液，用乙醇定容至25 mL。分別取1 mL上述溶液，分別依次加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL（0.2 mol/L）和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，于50℃恒溫反應(yīng)20 min，急速冷卻后，加2.5 mL 10%的三氯乙酸，混勻后6 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，分別加蒸餾水2.5 mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻，靜置10 min后，在700 nm測定吸光度。以空白試劑作為陰性對照，以VC溶液為陽性對照，每個樣品重復(fù)測3次，取平均值。吸光度值越大，表明樣品總還原能力越強。

1.4 乙酸乙酯部分的提取分離

結(jié)合參考文獻[22，24]，另取雪菊 235 g，重復(fù) 1.2的操作，得到乙酸乙酯部分3.3 g。將乙酸乙酯部分加少量10%乙醇溶解，經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂柱中，依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液沖洗。流出液點硅膠薄層，如圖1，70%乙醇沖洗液斑點清晰可見。70%乙醇部分回收至完全干燥，用少量無水乙醇溶解，加入少量柱層析硅膠，加熱，待無水乙醇完全蒸干得到硅膠樣品。將樣品上入硅膠柱中，依次用氯仿、氯仿∶甲醇（9∶1，體積比）、氯仿∶甲醇（8∶2，體積比）、氯仿∶甲醇（7∶3，體積比）沖洗，流出液分別點硅膠薄層，如圖2，氯仿∶甲醇（9∶1，體積比）部分的流[11]出液斑點清晰可見。將氯仿∶甲醇（9∶1，體積比）的部分回收，用丙酮重結(jié)晶，抽濾，減壓真空（60℃）干燥24 h，得到化合物1。

圖1 70%乙醇流出液的硅膠薄層Fig.1 Silica gel thin-layer chromatography of 70%ethanol solution

圖2 氯仿∶甲醇（9∶1）流出液硅膠薄層Fig.2 Silica gel thin-layer chromatography of chloroform∶methanol（9 ∶1）solution

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化活性的結(jié)果

2.1.1 DPPH法進行了抗氧化活性的測定

將石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位分別用DPPH法進行抗氧化活性的測定，結(jié)果顯示，正丁醇部位清除率為96.97%，其次是乙酸乙酯部位為93.86%，石油醚部位清除率為87.72%。但若與相同濃度的VC相比，正丁醇部位的抗氧化活性不如VC的抗氧化活性。結(jié)果表明，正丁醇提取部位發(fā)揮清除DPPH自由基作用的成分較多，且這些成分大部分是極性較大的成分，可能多為黃酮類化合物的苷類物質(zhì)。

2.1.2 雪菊各提取部位清除·OH的能力

將石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位分別用水楊酸法進行清除·OH的測定，結(jié)果顯示，當(dāng)所有提取部位濃度為1 mg/mL時，乙酸乙酯部位對羥基的清除能力最強，達到85.96%，其次是正丁醇部位，達到80.23%，石油醚部位對羥基的清除能力最低，只有21.31%。但若與相同濃度的VC相比，清除羥基自由基的能力均小于等于相同濃度VC。結(jié)果表明，雪菊各提取部位清除羥基自由基的能力與提取部位的濃度和各提取部位的化學(xué)成分相關(guān)。雪菊清除羥基自由基的能力可能與黃酮類化合物的苷元相關(guān)。

2.1.3 總還原能力的測定

將石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位分別用鐵離子還原能力法進行總還原能力的測定，結(jié)果顯示，當(dāng)所有提取部位濃度為1 mg/mL時，其還原能力由強到弱依次為乙酸乙酯提取部位＞正丁醇提取部位＞氯仿提取部位＞石油醚部位。結(jié)果表明，不同溶劑提取部位的總還原能力不同，乙酸乙酯部位最大，可能與其黃酮類成分含量最高有關(guān)系。

2.2 化合物1的表征

化合物1的紅外光譜如圖3所示，3 440 cm-1是-OH伸縮振動吸收峰，1 638 cm-1是苯環(huán)上C=C骨架振動的吸收峰，827 cm-1是苯環(huán)上C-H面外彎曲振動的吸收峰。

圖3 化合物1的紅外圖譜Fig.3 The IR spectrum of compound 1

化合物2的1HNMR如圖4所示，根據(jù)文獻推斷[23]，其結(jié)構(gòu)可能為對羥基苯丙烯酸。在化學(xué)位移值7.5左右的峰是苯環(huán)上的氫，化學(xué)位移6.9和7.9的峰分別是碳碳雙鍵上的2個氫，化學(xué)位移10.81是-OH的峰，13.00是-COOH的峰。

3 結(jié)論

用75%的乙醇加熱回流提取法提取昆侖雪菊中的化學(xué)成分，有機溶劑分別萃取得到了石油醚部位，氯仿部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位。DPPH法分別測定4個提取部位的抗氧化活性，結(jié)果表明，正丁醇部位的抗氧化活性最強，其次是乙酸乙酯部位。用水楊酸法進行了其清除·OH的測定，結(jié)果表明，乙酸乙酯部位對羥基自由基清除能力最強。采用鐵離子還原能力測定法測定各提取部位的總還原能力，乙酸乙酯部位總還原能力最強。用分別用大孔樹脂柱和硅膠柱對乙酸乙酯部位進行了分離，得到化合物1。由紅外圖譜和1H-NMR進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)合參考文獻[22]，得到的化合物1為苯丙烯酸的類似物。

圖4 化合物1的1HNMR圖譜Fig.4 The1HNMR spectrum of compound 1