肖志剛，段慶松，段玉敏，朱旻鵬，蘇 爽，何 東，高育哲

(1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院，沈陽 110034； 2.沈陽師范大學(xué) 學(xué)前與初等教育學(xué)院，沈陽 110034)

米糠是稻米加工過程的主要副產(chǎn)物，主要由果皮、種皮、胚乳和糊粉層組成[1]。米糠中蛋白質(zhì)含量豐富，占10%～16%。米糠蛋白組成為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，含量分別為37%、36%、22%、5%[2]，其中，谷蛋白作為米糠中主要的不溶性蛋白，較清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白具有較高的必需氨基酸含量[3]，研究米糠谷蛋白的提取對于探索其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

目前提取米糠谷蛋白的主要方法為Osborne法，該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH條件下的溶解性不同且等電點處溶解度最低的特點，采取堿溶酸沉法將多種蛋白質(zhì)分級提取出來，但Osborne法分離米糠谷蛋白的提取率較低[4]。提取前對米糠進(jìn)行輔助處理有助于提高蛋白的提取率。微波可滲透分子內(nèi)部，增加分子運動，對氫鍵、疏水鍵產(chǎn)生作用，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象與活性。本試驗采用微波對米糠進(jìn)行預(yù)處理后，利用Osborne法提取米糠谷蛋白，確定最優(yōu)提取條件，并將微波、未微波處理提取的米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)進(jìn)行比較，為米糠谷蛋白的開發(fā)和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

龍粳31號大米米糠(水分含量11.92%)，遼寧盛寶天隆米業(yè)。SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒，考馬斯亮藍(lán)R-250，十二烷基硫酸鈉，鹽酸胍，5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸，其他試劑均為分析純。

DWF-100型電動粉碎機(jī)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)，Ntcolet 5DXC紅外光譜儀，SU3500掃描電鏡，DELTA320型pH 計，MAS-II PLUS常壓微波萃取儀，SRD-200凱氏定氮儀，F(xiàn)97熒光分光光度計，J810圓二色譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白

根據(jù)Osborne[2]的分級原理并加以修改。將新鮮米糠過0.28 mm(50目)篩，稱取50 g于200 mL蒸餾水中，在一定的微波功率、微波時間和微波溫度下對米糠進(jìn)行微波處理，再根據(jù)Osborne法進(jìn)行谷蛋白提取。采用GB 5009.5—2016凱氏定氮法測定谷蛋白含量，按公式(1)計算米糠谷蛋白提取率(Y)。

Y=m1/m×100%

(1)

式中：m1為提取液中谷蛋白含量；m為原料中谷蛋白含量。

1.2.2 米糠谷蛋白掃描電鏡分析

將米糠谷蛋白冷凍干燥處理，并用掃描電鏡對米糠谷蛋白進(jìn)行形貌觀察。將待觀察的樣品涂在導(dǎo)電膠帶上，并涂上一層5 mm厚的金屬，設(shè)置電壓5 kV，于500×放大倍數(shù)下選擇合適視野，拍攝米糠谷蛋白形貌特征。

1.2.3 米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)分析

1.2.3.1 紅外光譜分析

將1 mg米糠谷蛋白樣品與100 mg溴化鉀混勻，壓制成片進(jìn)行紅外光譜分析，光譜掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.3.2 圓二色譜分析

參考文獻(xiàn)[7]的方法并加以改進(jìn)。取10 mg待測樣品，加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5，0.005 mol/L),充分混合之后，將溶液倒入吸收池，將其放在圓二色譜儀中掃描，以190～250 nm作為掃描范圍，掃描速度100 nm/min，利用Spectra Analysis軟件對圖譜進(jìn)行函數(shù)平滑，利用儀器附帶Jasco二級結(jié)構(gòu)估值程序估算待測樣品的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 米糠谷蛋白的功能性質(zhì)分析

1.2.4.1 溶解性測定

準(zhǔn)確稱取2 g的米糠谷蛋白溶于10 mL蒸餾水中，調(diào)pH為7.0，室溫攪拌1 h，于8 000 r/min離心20 min，然后用凱氏定氮法測定上清液的含氮量。溶解性用氮溶指數(shù)表示，按公式(2)計算。

INS=x1/x×100%

(2)

式中：INS為氮溶指數(shù)值；x1為上清液含氮量；x為樣品總含氮量。

1.2.4.2 持水性和持油性測定

稱取0.1 g米糠谷蛋白溶于5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液或大豆油中，室溫下渦旋3 min，于5 000 r/min離心20 min，稱取離心后沉淀的質(zhì)量。按照公式(3)計算持水性(y1)或持油性(y2)。

(3)

式中：m為米糠谷蛋白的質(zhì)量；m1為離心后沉淀的質(zhì)量。

1.2.4.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

采用文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行測定。稱取0.2 g米糠谷蛋白溶于20 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，混勻，從中取15 mL與5 mL大豆油混合，以10 000 r/min均質(zhì)3 min。將50 μL的底部乳液與5 mL 0.1%的SDS完全混合，然后在500 nm處測定吸光度(A0)(對照組為0.1%SDS)。靜置10 min后再次從底部各取50 μL樣品，用5 mL 0.1%SDS溶液稀釋，測定吸光度(A10)。乳化活性(IEA)和乳化穩(wěn)定性(IES)分別按公式(4)和公式(5)計算。

(4)

(5)

式中：N為稀釋倍數(shù)；φ為體系中油相體積分?jǐn)?shù)；C為樣品溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；ΔT為兩次間隔時間差。

1.2.4.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

采用文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測定，并加以修改。準(zhǔn)確稱量0.2 g米糠谷蛋白與20 mL 0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液于50 mL燒杯中混勻。使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)3 min，測均質(zhì)后液面體積(V0)，在室溫下靜置30 min后再讀取液面體積(V30)。起泡性(H1)和泡沫穩(wěn)定性(H2)分別按照公式(6)和公式(7)計算。

(6)

(7)

1.2.5 米糠谷蛋白表面疏水性的測定

參考文獻(xiàn)[10]方法采用ANS探針法測定米糠谷蛋白的表面疏水性。用磷酸緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)制備8 mmol/L ANS溶液，加入一定量的米糠谷蛋白，使其充分溶解，在8 000 r/min下離心20 min，除去沉淀，以Lowery法計算米糠谷蛋白質(zhì)量濃度。通過磷酸緩沖溶液的稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為0.05～0.15 mg/mL的米糠谷蛋白溶液，取40 μL ANS溶液滴加至不同質(zhì)量濃度的米糠谷蛋白溶液中，避光靜置15 min，然后進(jìn)行測試。測試條件為激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，掃描夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與米糠谷蛋白質(zhì)量濃度做線性圖，以初始段的斜率值計為米糠谷蛋白的表面疏水性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理，采用SPSS.24軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對米糠谷蛋白提取率的影響

在微波時間15 min、微波溫度35℃條件下，考察微波功率對米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 微波功率對米糠谷蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨微波功率的增加，米糠谷蛋白提取率不斷增加，在微波功率為700 W時達(dá)到最高(72.5%)。這可能是在微波處理時，米糠細(xì)胞壁被破碎，內(nèi)部氫鍵以及二硫鍵被破壞，蛋白質(zhì)易于溶出，谷蛋白提取率升高。微波功率超過700 W后，米糠谷蛋白提取率降低。因此，選定微波功率為700 W。

2.1.2 微波時間對米糠谷蛋白提取率的影響

在微波功率700 W、微波溫度35℃條件下，考察微波時間對米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 微波時間對米糠谷蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨微波時間的延長，米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在微波時間超過15 min后，米糠谷蛋白提取率不斷降低。原因是在微波的作用下，微波時間過長，蛋白質(zhì)分子氫鍵以及基團(tuán)發(fā)生改變，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來，疏水殘基相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)難以溶出，使谷蛋白提取率降低。因此，選定微波時間為15 min。

2.1.3 微波溫度對米糠谷蛋白提取率的影響

在微波時間15 min、微波功率700 W條件下，考察微波溫度對米糠谷蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 微波溫度對米糠谷蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨微波溫度的升高，米糠谷蛋白提取率呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，在40℃時米糠谷蛋白提取率達(dá)到最大，之后繼續(xù)升高溫度，米糠谷蛋白提取率下降。在微波作用下，隨著溫度的升高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，蛋白質(zhì)中二硫鍵被破壞，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，從而提高了蛋白提取率。因此，選定微波溫度為45℃。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用三因素三水平的正交試驗對米糠谷蛋白提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可見，各因素對米糠谷蛋白提取率影響大小依次為A>C>B，即微波功率>微波溫度>微波時間，最優(yōu)方案為A3B3C2。結(jié)合單因素試驗結(jié)果，最終確定最優(yōu)工藝方案為A3B2C2，即微波功率800 W、微波時間15 min、微波溫度40℃。在最優(yōu)方案下，米糠谷蛋白提取率為73.1%。

2.3 微波處理對米糠谷蛋白性質(zhì)的影響

2.3.1 微波處理前后米糠谷蛋白的掃描電鏡圖

采用掃描電鏡觀察微波處理前后米糠谷蛋白表面形貌，結(jié)果見圖4。

圖4 微波處理前后米糠谷蛋白掃描電鏡圖

由圖4可知，米糠谷蛋白表面多孔，經(jīng)過微波處理后蛋白表面孔隙增大，其原因可能與微波處理后堿液提取的米糠谷蛋白非共價鍵的相互作用增強(qiáng)有關(guān)。

2.3.2 微波處理對米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖5是微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖，表3為米糠谷蛋白的圓二色譜測定結(jié)果。由圖5可見，微波處理前后的米糠谷蛋白的紅外光譜圖走勢相似，但在二級結(jié)構(gòu)上存在很大差異。米糠谷蛋白在1 700 cm-1附近的振動峰是由C—N伸縮振動和N—H面內(nèi)變形振動所形成的α-螺旋和β-折疊，在3 000 cm-1附近的振動峰均是由 —CH2和 —CH3伸縮振動引起的。蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊是比較有序的蛋白結(jié)構(gòu)，具有較高的穩(wěn)定性[15]。由表3可知，微波處理后，米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移，β-折疊含量明顯提高，因此微波處理后的米糠谷蛋白有較高的穩(wěn)定性。

圖5 微波處理前后米糠谷蛋白的紅外光譜圖

表3 米糠谷蛋白的圓二色譜測定結(jié)果%

2.3.3 微波處理對米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響(見表4)

米糠谷蛋白是具有較大空間結(jié)構(gòu)的大分子類物質(zhì)，分子內(nèi)的大量基團(tuán)在受到外界影響時會發(fā)生某些變化，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)[11]。由表4可知，米糠經(jīng)過微波處理后所提取的米糠谷蛋白功能性質(zhì)發(fā)生改變，溶解性提高了8.12百分點，持水性升高了0.89百分點，持油性降低了0.84百分點。郝天舒等[12]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理提高了米糠蛋白的溶解性，可能是與蛋白氨基酸分布有關(guān)。米糠經(jīng)過微波處理后，米糠谷蛋白二級結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致親水基團(tuán)暴露，加劇了蛋白質(zhì)分子的氫鍵和離子基團(tuán)的水合作用，蛋白持水性升高。微波處理后米糠谷蛋白起泡性增加了20.41百分點，泡沫穩(wěn)定性則降低了21.66百分點。這可能是因為微波處理后，米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)展開，更易吸附到空氣-水界面上，形成泡沫，這與Adam等[13]的研究結(jié)果一致。微波處理后，米糠谷蛋白乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點，但乳化活性降低了4.61百分點，這可能是微波處理破壞了米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)，致使疏水基團(tuán)疏遠(yuǎn)水相，從而降低了乳化活性[14]。

表4 微波處理對米糠谷蛋白功能性質(zhì)的影響

2.3.4 微波處理對米糠谷蛋白表面疏水性的影響(見圖6)

圖6 微波功率對米糠谷蛋白表面疏水性的影響

由圖6可知，隨著微波功率的增加，米糠谷蛋白表面疏水性總體逐漸增加，且均高于未微波處理的。表明微波處理后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)分子表面。

3 結(jié) 論

本研究采用微波輔助Osborne法提取米糠谷蛋白，在微波功率800 W、微波時間15 min、微波溫度40℃條件下，米糠谷蛋白提取率達(dá)到73.1%。微波處理后米糠谷蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)移，β-折疊含量明顯提高。微波處理后，米糠谷蛋白的溶解性提高了8.12百分點，持水性升高了0.89百分點，起泡性增加了20.41百分點，乳化穩(wěn)定性增加了5.50百分點，持油性降低了0.84百分點，乳化活性降低了4.61百分點，泡沫穩(wěn)定性降低了21.66百分點。米糠谷蛋白表面疏水性隨微波功率增加總體逐漸增大。本研究可為米糠谷蛋白的工業(yè)化制備及在各種食品配方中的應(yīng)用提供理論支撐。