朱新儒，余壘，張海德

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

傳統(tǒng)的提取技術(shù)有鹽析法、有機(jī)溶劑法、親和層析法以及超濾法等[1]。然而這些技術(shù)存在諸如工藝過程繁瑣、溶劑的組成成分有毒、提取率較低以及成本較高等局限性[2]。雙水相（aqueous two-phase system，ATPS）萃取技術(shù)，亦稱水溶液兩相分配技術(shù)，是現(xiàn)階段的一種分離新技術(shù)[3]。雙水相體系的優(yōu)點(diǎn)明顯，如生物相容性高、操作時(shí)間短、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作條件溫和、易于連續(xù)化操作和工藝放大等[4]，因此被廣泛運(yùn)用。

近年來，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者們已經(jīng)對(duì)雙水相體系進(jìn)行了全面的研究，包括新型雙水相體系的開發(fā)、雙水相體系中物理性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，體系分配模型的建立、傳質(zhì)性能的研究、生物活性物質(zhì)的分配行為、萃取工藝參數(shù)的優(yōu)化、以及離子液體聚合物的回收[5-7]等，這些研究都已取得很大進(jìn)展。國(guó)外關(guān)于雙水相模型的研究較成熟些。Diamond等[8]提出了Diamond-Hsu模型，該模型在一定程度上對(duì)聚合物雙水相體系的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了很好的擬合。國(guó)內(nèi)目前關(guān)于雙水相模型的研究還不夠完善，國(guó)內(nèi)主要的模型是：滲維里模型、Flory-Huggins晶格模型、胞腔理論和局部組成模型。這4種理論相互獨(dú)立，又互相影響，分別從滲透壓、能量、分子間作用力及溶液組成幾個(gè)方面進(jìn)行了闡述[9]。此外，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者們對(duì)于雙水相的研究現(xiàn)多集中在基于吡啶的離子液體上，因?yàn)橄嚓P(guān)研究已經(jīng)表明，吡啶類物質(zhì)的生物降解途徑通常比其基于咪唑等的對(duì)應(yīng)物更環(huán)保[10]。

現(xiàn)階段，關(guān)于各類雙水相體系相行為的研究層出不窮。Dragana P.C.de Barros等[11]在聚合物/聚合物ATPS中探討具有不同性質(zhì)的14種球狀蛋白的分配行為。通過Colander方程，觀察到所有系統(tǒng)中的蛋白分配系數(shù)之間的線性相關(guān)性。結(jié)果表明使用半經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分配行為。Luisa A[12]對(duì)聚乙二醇/葡聚糖體系的分配系數(shù)與聚乙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明對(duì)于雙聚合物體系的分配系數(shù)的預(yù)測(cè)效果較好。

目前相關(guān)的研究報(bào)道酶在離子液體/鹽雙水相體系的分配系數(shù)K的大小主要是由鹽析作用、表面電荷、疏水相互作用等因素共同決定的[13]，而對(duì)酶在氯代吡啶類離子液體雙水相中分配行為的預(yù)測(cè)及模型建立的研究則較少。為探討木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體雙水相體系中的分配規(guī)律，試驗(yàn)測(cè)定了[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系的雙節(jié)線及液液相平衡數(shù)據(jù)并進(jìn)行關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步對(duì)木瓜蛋白酶在該體系中的蛋白濃度分配系數(shù)與上下相各成分濃度的相關(guān)度進(jìn)行研究，以此建立木瓜蛋白酶在該類離子液體雙水相體系中的分配模型，研究結(jié)果也可為木瓜蛋白酶在該體系中的工程放大設(shè)計(jì)計(jì)算提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N-正乙基吡啶氯鹽（EPyCl）、N-正丁基吡啶氯鹽（BPyCl）、N-正己基吡啶氯鹽（HPyCl）均為海南大學(xué)李運(yùn)強(qiáng)理工實(shí)驗(yàn)大樓C513試驗(yàn)室合成的離子液體試劑（純度＞90%）；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：上海生工股份有限公司；K2HPO4（AR）、氫氧化鈉（AR）、鹽酸（AR）：阿拉丁化學(xué)試劑公司；其他所有試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-2F PH計(jì)：上海雷磁儀器廠；2WAJ阿貝折射儀：上海光學(xué)儀器一廠；TU1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司；DK-98-1恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；DF-2A集熱式磁力攪拌器：常州華奧儀器制造有限公司；WH-866旋渦混合器：太倉(cāng)市華利達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 相圖的測(cè)定

參照高向陽(yáng)等[14]方法，測(cè)定相圖：在25℃的體系環(huán)境下，采用清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法測(cè)定氯代吡啶類離子液體雙水相體系的雙節(jié)線。進(jìn)一步選取適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)配制相應(yīng)濃度的溶液體系，繪制三角相圖。分別量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50%的 [C2Py]Cl、[C4Py]Cl、[C6Py]Cl溶液放在10.0 mL小試管中，用移液槍逐滴向小試管中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的K2HPO4溶液，用旋渦混合器振蕩，觀察到體系出現(xiàn)渾濁點(diǎn)為止。在分析天平上稱量后計(jì)算出氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液在渾濁點(diǎn)時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。隨后向已渾濁的雙水相體系中逐滴加入超純水，觀察到體系又變澄清為止，即出現(xiàn)清點(diǎn)。準(zhǔn)確稱量后，再向試管中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的K2HPO4溶液，至體系再次變渾濁為止。依次交替加入超純水和K2HPO4溶液，計(jì)算每一個(gè)清點(diǎn)、濁點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 雙水相相平衡的測(cè)定

參照盧艷敏等[15]方法，根據(jù)三角相圖選取適當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的點(diǎn)配制雙水相體系。在25℃的恒溫環(huán)境下，分別量取不同質(zhì)量的氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液加到10.0 mL離心管中，隨后補(bǔ)加超純水，在旋渦混合器中振蕩30 min，在該環(huán)境溫度下放置2.0 h，待溶液上下相分相清晰，確保體系達(dá)到完全平衡。按照參考文獻(xiàn)[16]中所述，用折射率來確定雙水相體系上下相的氯代吡啶類離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過酸堿中和滴定法[17]來確定兩相中K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

折射率n、氯代吡啶類離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wil、K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ws，三者關(guān)系式如下：

式中：a0、a1、a2為方程參數(shù)，見表1。

表1 [CnPy]Cl-K2HPO4雙水相方程式（1）參數(shù)Table 1 Parameters of equation（1）for[CnPy]Cl-K2HPO4 aqueous two-phase system

1.3.3 氯代吡啶類離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶及蛋白濃度的測(cè)定

參照邵琳琳等[18]方法，根據(jù)三角相圖選取適當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的點(diǎn)配制雙水相體系。向10.0 mL離心管中加入氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液，使雙水相體系的總體積為1.0 mL。再加入質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL（木瓜蛋白酶的質(zhì)量/雙水相體系總體積）酶溶液，調(diào)節(jié)體系pH值為7.0，旋渦混合器中振蕩30 min，在25℃溫度下放置2.0 h，使溶液上下相完全分相。將上、下相液分離并準(zhǔn)確讀取體積。用超純水將上、下相液均稀釋10倍，備用。吸取1.0 mL的待測(cè)溶液轉(zhuǎn)移到10.0 mL試管中，再向試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)（G-250）染色液，充分振蕩使之混勻。設(shè)置空白對(duì)照組，不加酶溶液，在595 nm波長(zhǎng)處比色，讀取吸光值A(chǔ)，計(jì)算木瓜蛋白酶的蛋白含量[19]。由于實(shí)際操作過程中僅添加了較少量的木瓜蛋白酶，對(duì)折射率的測(cè)定影響較小，相對(duì)誤差小于0.2%，所以使用該方法測(cè)定組分含量的結(jié)果準(zhǔn)確。

以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定其溶液在不同濃度下的吸光度值，繪制BSA-Abs標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線公式為：y=0.013 6+0.004 5x，R2=0.998 1，符合質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見圖1。

圖1 BSA-Abs標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 BSA-Abs standard curve

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin8.5處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，每組處理均做3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)及三角相圖的繪制

試驗(yàn)中運(yùn)用Merchuk方程關(guān)聯(lián)體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)，并繪制體系的三角相圖，Merchuk方程形式如下：

式中：a、b、c為方程擬合參數(shù)，利用濁點(diǎn)數(shù)據(jù)的最小二乘回歸算出；wil和ws分別代表[CnPy]Cl和K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Merchuk方程的形式簡(jiǎn)單，較好地運(yùn)用于離子液體/鹽雙水相體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，且關(guān)聯(lián)效果較好[20]。分別以氯代吡啶類離子液體、K2HPO4、水為3個(gè)頂點(diǎn)，制作三角相圖，見圖2。

圖2 25℃溫度下[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系三角相圖Fig.2 Triangular phase diagram for[CnPy]Cl（n=2，4，6）-K2HPO4 system at 25℃

由圖2（a）、2（b）、2（c）可得，雙節(jié)線是單相區(qū)與雙相區(qū)的臨界線，表示雙水相達(dá)到平衡，雙節(jié)線左側(cè)是單相區(qū)，此時(shí)溶液是均一的相，無分層現(xiàn)象；右側(cè)是雙相區(qū)，它是無限多個(gè)不同濃度組成的兩相系統(tǒng)，上相是氯代吡啶離子液體富集相，下相是K2HPO4富集相。25℃時(shí)[CnPy]Cl-K2HPO4體系雙節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果見表2。

表2 25℃時(shí)[CnPy]Cl-K2HPO4體系雙節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 2 Binodal correlation results of[CnPy]Cl-K2HPO4system at 25℃

由表2可知，試驗(yàn)所得的雙節(jié)線數(shù)據(jù)能很好地滿足Merchuk方程，可為此體系雙水相相圖的繪制提供參考，且可根據(jù)相圖，選擇雙水相體系成相劑的濃度。

2.2 運(yùn)用Othmer-Tobias方程和Bancroft方程擬合體系的液液相平衡關(guān)系

Othmer-Tobias方程和Bancroft方程近年來已經(jīng)成功應(yīng)用于擬合離子液體/無機(jī)鹽雙水相體系的液液相平衡關(guān)系，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程的表達(dá)式分別如下[21]

式中：K、n、K'、n'為方程的參數(shù)，見表3；wilt代表上相離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，wsb代表下相K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；wwt、wsb分別代表上、下相水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對(duì)方程兩邊取對(duì)數(shù)，在Othmer-Tobias方程中，以lg[（1-wwb）/wwb]為橫坐標(biāo)，以lg[（1-wilt）/wilt]為縱坐標(biāo)，進(jìn)行擬合并繪制圖3。在Bancroft方程中，以lg[wwt/wilt]為橫坐標(biāo)，以lg[wwb/wsb]為縱坐標(biāo)，進(jìn)行擬合并繪制圖4。式中，n、n'為斜率，lgK、lgK'為截距。

表3 [CnPy]Cl-K2HPO4雙水相方程式（3）和（4）中的參數(shù)Table 3 Parameters of Equation.（3）and（4）for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖3 Othmer-Tobias方程的線性相關(guān)性Fig.3 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

從表3中的 R2值（＞0.995）可看出，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程很好地?cái)M合了試驗(yàn)中的雙水相體系的液液相平衡數(shù)據(jù)。

由圖3、圖4可得，lg[（1-wwb）/wwb]與lg[（1-wilt）/wilt]，lg[wwt/wilt]與 lg[wwb/wsb]分別呈線性關(guān)系，表明相關(guān)性很好。

由相關(guān)參數(shù)和體系下相中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以計(jì)算出體系上相中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。體系的液液相平衡數(shù)據(jù)見表4。

由表4可得，[C2Py]Cl、[C4Py]Cl和 [C6Py]Cl的平均相對(duì)誤差分別為：0.72×10-3%、-3.95×10-3%、0.75×10-3%；K2HPO4的平均相對(duì)誤差分別為：-0.65×10-3%、-2.20×10-3%、-1.13×10-3%。由此可得方程擬合結(jié)果較滿意。

圖4 Bancroft方程的線性相關(guān)性Fig.4 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 分配模型的建立

離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶，酶的蛋白濃度分配系數(shù)K定義為：雙水相體系分相后，上、下相中各自的木瓜蛋白酶蛋白濃度的比值，公式如下

式中：Ct、Cb分別為上、下相中的木瓜蛋白酶蛋白濃度，mg/mL。

表4 25℃時(shí)[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系的液液相平衡擬合結(jié)果Table 4 The result of liquid-liquid equilibrium for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system at 25℃

測(cè)定該體系上下相中木瓜蛋白酶濃度及各組分的含量，對(duì)上下相各組分含量和分配系數(shù)K之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，相關(guān)性越接近于1，說明相關(guān)性越好[22]，數(shù)據(jù)則可用于模型的建立；反之，相關(guān)性差不可用。選擇相關(guān)性接近1的一組或幾組數(shù)據(jù)，進(jìn)行模型的建立。

變量x和y之間的相關(guān)性定義為：

木瓜蛋白酶的分配系數(shù)與參數(shù)的相關(guān)性見表5。

由表5可得，上下相離子液體濃度差、上下相鹽濃度差與lnK的相關(guān)性較高，均在0.75以上。

將上下相中氯代吡啶類離子液體的濃度差、上下相中K2HPO4的濃度差與該雙水相體系的lnK值進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得出如下公式：

式中：A、B、C為方程參數(shù)，L=（wil2+ws2）1/2（wil：上、下相中氯代吡啶類離子液體的濃度差；ws：上、下相K2HPO4的濃度差）。分別以[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系中的L值為橫坐標(biāo)，以lnK值為縱坐標(biāo)，利用K與L（系線的長(zhǎng)度）[23]之間的相關(guān)性建立了模型。

模型的參數(shù)、分配系數(shù)的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的相對(duì)偏差見下表6。

表5 分配系數(shù)與[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系組分濃度的相關(guān)性Table 5 Correlation between partition coefficient and the components concentration of[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

表6 模型的參數(shù)和分配系數(shù)預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的相對(duì)偏差Table 6 Parameters for models and relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

由表6可得，與其他離子液體雙水相體系，如曹玲[24]研究的[Emim][（CF3SO2）2N]體系的分配模型（相對(duì)偏差為8.36%）相比，試驗(yàn)建立的模型有更小的平均相對(duì)偏差。試驗(yàn)值與計(jì)算值之間一致性良好，表明該模型預(yù)測(cè)能力很好。

木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體雙水相體系中的蛋白濃度分配系數(shù)和上下相組分濃度差的關(guān)聯(lián)結(jié)果見圖5、圖6和圖7。

圖5 [C2Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數(shù)的實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值Fig.5 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C2Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖6 [C4Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數(shù)的實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值Fig.6 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C4Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖7 [C6Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數(shù)的實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值Fig.7 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C6Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

由圖5～圖7可知，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.985、0.993、0.981，結(jié)果較滿意。該模型的相對(duì)偏差均小于4%，并且與蔡濤[25]研究的[Cnmim]BF4-NaH2PO4咪唑類離子液體/鹽雙水相體系的分配模型（相對(duì)偏差5%）相比較小，表明本試驗(yàn)建立的模型精確度得到進(jìn)一步提高，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體/鹽雙水相系統(tǒng)中分配系數(shù)K的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)在25℃條件下，利用清-濁點(diǎn)輔助法測(cè)定了[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體/鹽雙水相體系的雙節(jié)線數(shù)據(jù)及液液相平衡數(shù)據(jù)，并繪制該體系的三角相圖。用Merchuk方程、Othmer-Tobias和Bancroft方程擬合數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.995以上，平均相對(duì)誤差均低于0.1%，結(jié)果表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合效果很成功。進(jìn)一步用 [CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系探討不同碳鏈長(zhǎng)度的氯代吡啶類離子液體對(duì)木瓜蛋白酶的分配系數(shù)的影響規(guī)律，建立的模型可較好地預(yù)測(cè)不同碳鏈長(zhǎng)度的氯代吡啶類離子液體對(duì)木瓜蛋白酶的萃取能力，補(bǔ)充了酶在雙水相系統(tǒng)的分配模型數(shù)據(jù)庫(kù)。