王曉杰 曲 悅 劉曉蘭 叢萬(wàn)鎖

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米中含有64%～78%的淀粉，通常作為生產(chǎn)淀粉的原料。在濕磨法玉米淀粉生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)生了玉米加工量6.12%的玉米蛋白粉。玉米蛋白粉中含有4種溶解性不同的蛋白質(zhì)，分別為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白[1]。其中，玉米谷蛋白是由20多種分子量在11～127 kDa的蛋白質(zhì)亞基通過(guò)二硫鍵等緊密結(jié)合而形成的巨大、復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)，其不溶于中性水溶液和乙醇溶液，僅溶于稀酸或稀堿溶液[2]。玉米谷蛋白水溶性差的特性限制了這一量大、廉價(jià)、有優(yōu)良功能潛力的植物蛋白在食品工業(yè)的應(yīng)用。

目前，為了提高玉米蛋白的水溶性，主要采用化學(xué)法對(duì)其進(jìn)行改性處理，包括磷酸化[3]、琥珀?；痆4]與糖基化[5-6]等。其中，糖基化改性是利用糖類物質(zhì)的多羥基特性改善食物蛋白質(zhì)的親水—親油平衡，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)在水相中的溶解性等功能特性，采用的方法包括美拉德反應(yīng)和酶法糖基化。其中，酶法糖基化改性具有反應(yīng)特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物食用安全等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于大豆蛋白[7]、酪蛋白[8]、乳清蛋白[9]、豌豆蛋白[10]、燕麥麩皮球蛋白[11]等食物蛋白質(zhì)的改性中，顯示出良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)與前景。

酶法糖基化改性是以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)為催化劑，利用其?；D(zhuǎn)移能力催化氨基糖與蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基之間異肽鍵的形成。玉米谷蛋白中谷氨酰胺殘基含量高達(dá)34%[12]，是酶法糖基化改性的良好底物。但到目前為止，僅見用殼寡糖對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行糖基化改性的報(bào)道[13]。未見對(duì)改性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)進(jìn)行的研究，也未見用其他氨基糖對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行改性的報(bào)道。在前期研究工作中，本課題組已經(jīng)建立了TGase和D-氨基半乳糖改性玉米谷蛋白的反應(yīng)體系。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬以D-氨基半乳糖糖基化改性玉米谷蛋白為原料，研究糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)及抗氧化活性的影響，為糖基化改性玉米谷蛋白在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

D-氨基半乳糖：分析純，上海御略化工有限公司；

TGase：食品級(jí)，酶活力1 000 U/g，泰興市一鳴生物制品有限公司；

鄰苯二甲醛、菲洛嗪、硫代巴比妥酸：分析純，上海生工生物有限公司；

DPPH、2-脫氧-D-核糖：分析純，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

差示掃描量熱儀：Q-20型，美國(guó)TA儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum One型，美國(guó)Perkin Elmer公司；

雙光束紫外可見分光光度計(jì)：TU1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米谷蛋白的提取 參照文獻(xiàn)[13]。玉米蛋白粉經(jīng)擠壓膨化、去淀粉和脫色處理后，用70%乙醇萃取兩次。將兩次萃取后的沉淀按1∶10(g/mL)加入0.1 mol/L NaOH溶液，50～60 ℃條件下水浴振蕩2 h。水浴結(jié)束后，4 500 r/min離心10 min，沉淀再用相同條件萃取1次，將兩次上清液合并。調(diào)節(jié)上清液pH至4.5～4.8，4 500 r/min 離心10 min，沉淀用70%乙醇靜置洗滌兩次，水洗兩次，取沉淀烘干，獲得玉米谷蛋白。

1.2.2 糖基化玉米谷蛋白的制備 向底物濃度為3 g/100 mL 的玉米谷蛋白懸浮液中添加D-氨基半乳糖(?；w與?；荏w的物質(zhì)的量比為1∶3)，按35 U/g·蛋白的加酶量加入TGase，在pH 7.7、44 ℃條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃熱處理5 min，鈍化反應(yīng)體系中的TGase。冷卻至室溫，用截?cái)喾肿淤|(zhì)量1 000 Da的透析袋除去反應(yīng)體系中未反應(yīng)的氨基糖。透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥后獲得糖基化玉米谷蛋白，貯存在干燥器中備用。

1.2.3 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物游離氨基含量的測(cè)定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法[14]。取3 mL一定濃度的待測(cè)樣品，與同體積的OPA溶液混合，反應(yīng)5 min后測(cè)定340 nm處的吸光度值。利用L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=2.583x+0.002，R2=0.999)計(jì)算樣品中游離氨基的含量。

1.2.4 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的紅外光譜分析

采用KBr壓片法制備兩種待測(cè)樣品，測(cè)定波數(shù)為4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜，分辨率為4 cm-1。

1.2.5 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物熱穩(wěn)定性的測(cè)定

精確稱取2.0 mg樣品放入鋁盒中，壓蓋密封后在升溫速率10 ℃/min、溫度范圍20～190 ℃的條件下進(jìn)行DSC掃描。通過(guò)變性峰的面積計(jì)算熱焓值，并得到相關(guān)蛋白的變性溫度。以密封空鋁盒作為對(duì)照。

1.2.6 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定 抗氧化活性的測(cè)定指標(biāo)包括3種自由基清除活性(包括DPPH、羥基和超氧陰離子自由基)、Fe2+螯合能力以及還原力，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

2.1.1 紅外光譜分析 在酶法糖基化改性研究中，普遍采用紅外光譜來(lái)鑒定氨基糖是否與底物蛋白質(zhì)發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖1所示。

圖1 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜圖Figure 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of corn glutelin and its modified production by the glycosylation

由圖1可以看出，玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的紅外光譜圖變化趨勢(shì)基本相同，僅在1 130～1 200 cm-1處略有差異，而1 200～1 000 cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C—O伸縮振動(dòng)所引起的，其中一種是屬于C—O—H的，另一種是糖環(huán)的C—O—C官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)和糖環(huán)存在的典型特征[15]。說(shuō)明在TGase的催化下，D-氨基半乳糖與玉米谷蛋白發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，但糖基結(jié)合量相對(duì)較低。

2.1.2 DSC分析 采用DSC考察糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖2和表1所示。

圖2 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的DSC曲線Figure 2 DSC profile of corn glutelin and its modified production by the glycosylation

表1 糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白變性溫度和熱變性焓的影響Table 1 Effect of the glycosylation modification on the denaturation temperature and enthalpy of thermal denaturation of corn glutelin (n=3)

由圖2可以看出，與玉米谷蛋白相比，糖基化改性產(chǎn)物的DSC曲線變淺，且波谷向左移動(dòng)。由表1可知，玉米谷蛋白的變性溫度及變性焓值分別為119.9 ℃和280.27 J/g，說(shuō)明玉米谷蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性，與其結(jié)構(gòu)緊密的特點(diǎn)相符。與玉米谷蛋白相比，糖基化改性玉米谷蛋白的變性溫度及變性焓分別降低9.03 ℃和68.74 J/g，說(shuō)明糖基化改性使玉米谷蛋白由有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序結(jié)構(gòu)，此時(shí)谷蛋白的結(jié)構(gòu)較為松散，熱穩(wěn)定性降低。這一結(jié)果與糖基化改性燕麥麩皮中的球蛋白結(jié)果[11]一致，但與玉米醇溶蛋白的糖基化改性結(jié)果[16]相矛盾，可能與底物蛋白質(zhì)的本身結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.1.3 游離氨基含量 玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的游離氨基含量的測(cè)定結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，玉米谷蛋白的游離氨基含量?jī)H為32 mmol/kg·蛋白，進(jìn)一步說(shuō)明了玉米谷蛋白的結(jié)構(gòu)緊密，將含有氨基的酰胺基氨基酸埋藏在分子內(nèi)部。在糖基化改性過(guò)程中，糖基化玉米谷蛋白的游離氨基含量顯著增加，達(dá)190 mmol/kg·蛋白，與美拉德反應(yīng)及大豆酶法糖基化改性的結(jié)果相矛盾[8,17]，可能是糖基化改性使玉米谷蛋白本身緊密的結(jié)構(gòu)變得松散，使分子內(nèi)部暴露出的游離氨基的含量遠(yuǎn)大于糖基化反應(yīng)損耗的游離氨基的含量，導(dǎo)致雖然酶法糖基化反應(yīng)發(fā)生，但游離氨基含量增加，與2.1.1紅外光譜分析的結(jié)論一致，即D-氨基半乳糖雖然與玉米谷蛋白發(fā)生了結(jié)合，但結(jié)合量較低。

表2糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白游離氨基含量的影響
Table 2Effect of the glycosylation modification on the free amino groups content of corn glutelin(n=3)

樣品名稱游離氨基含量/(mmol·kg-1·Prot)玉米谷蛋白 32.23±0.51糖基化玉米谷蛋白190.05±0.04

2.2 糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH自由基清除率 以玉米谷蛋白為對(duì)照，測(cè)定不同濃度下糖基化改性玉米谷蛋白對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 糖基化改性和蛋白濃度對(duì)玉米谷蛋白DPPH自由基清除率的影響Figure 3 Effect of the modification and protein content on the DPPH radical scavenging capacity of corn glutelin

由圖3可知，玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率均隨著樣品濃度的增加而逐漸增大，且糖基化改性產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力高于玉米谷蛋白。在濃度為2 mg/mL時(shí)，糖基化玉米谷蛋白的DPPH自由基清除率為74.49%，比玉米谷蛋白高8.23%。玉米谷蛋白及其糖基化產(chǎn)物清除DPPH自由基的EC50值分別為0.71，0.68 mg/mL，說(shuō)明TGase和D-氨基半乳糖的改性改善了玉米谷蛋白清除DPPH自由基的能力。分析可能有兩方面的原因：① 糖基化改性產(chǎn)物可以向DPPH自由基提供氫原子，使之形成穩(wěn)定的非活性化合物DPPH-H；② 糖基化改性使谷蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水基團(tuán)，這些疏水性基團(tuán)更易與脂溶性的DPPH自由基反應(yīng)，從而提升了對(duì)DPPH自由基的清除能力。

2.2.2 羥基自由基清除率 分別測(cè)定玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物的羥基自由基清除率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 糖基化改性和蛋白濃度對(duì)玉米谷蛋白羥基自由基清除率的影響Figure 4 Effect of the modification and protein content on the hydroxyl radical scavenging capacity of corn glutelin

由圖4可知，糖基化改性前后玉米谷蛋白均具有清除羥基自由基的能力，且同一濃度下，糖基化玉米谷蛋白的羥基自由基清除率均高于玉米谷蛋白，可能是糖基化玉米谷蛋白既是良好的供氫體，也是亞鐵離子螯合劑，能通過(guò)抑制Fenton反應(yīng)而減少羥基和超氧陰離子自由基的生成，提高自由基的清除能力[18]。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除活性 不同濃度下兩種待測(cè)樣本的超氧陰離子自由基清除率如圖5所示。

由圖5可知，與玉米谷蛋白相比，D-氨基半乳糖的糖基化改性使玉米谷蛋白清除超氧陰離子自由基的能力增強(qiáng)。在濃度為2 mg/mL時(shí)，糖基化產(chǎn)物的清除率為13.26%，比玉米谷蛋白高6.10%。這可能是因?yàn)樘腔男援a(chǎn)物分子中抗氧化活性的氨基酸與D-氨基半乳糖的伯、仲—OH的協(xié)同作用使鄰苯三酚在自氧化初期產(chǎn)生的超氧陰離子自由基形成穩(wěn)定的分子，或者與一些過(guò)氧化物的前體物反應(yīng)阻止過(guò)氧化物的生成，從而有效地阻斷了自由基的反應(yīng)鏈。

圖5 糖基化改性和蛋白濃度玉米谷蛋白超氧陰離子自由基清除率的影響Figure 5 Effect of the modification and protein content on the superoxide radical scavenging capacity of corn glutelin

2.2.4 還原力 分別測(cè)定玉米谷蛋白及其糖基化改性產(chǎn)物在700 nm處的吸光度值，以表征兩種待測(cè)樣品的還原能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 糖基化改性和蛋白濃度對(duì)玉米谷蛋白還原力的影響Figure 6 Effect of the modification and protein content on the reducing power of corn glutelin

由圖6可知，玉米谷蛋白具有還原力，但能力較弱，可能與玉米谷蛋白的結(jié)構(gòu)緊密、抗氧化氨基酸埋藏在分子內(nèi)有關(guān)。經(jīng)D-氨基半乳糖改性后，玉米谷蛋白的還原力顯著增加，在濃度為2 mg/mL時(shí)，糖基化改性產(chǎn)物的還原力為0.60，比同濃度玉米谷蛋白提高0.44。這可能是糖基化改性產(chǎn)物可以提供電子將Fe3+還原成Fe2+，使Fe2+發(fā)生Perl’s Prussian藍(lán)反應(yīng)，使普魯士藍(lán)的生成量增加，700 nm處吸光值升高，糖基化樣品的還原力增強(qiáng)[17]。

2.2.5 Fe2+螯合能力 分別測(cè)定玉米谷蛋白及D-氨基半乳糖糖基化改性產(chǎn)物的Fe2+螯合能力，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，玉米谷蛋白具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力，在濃度為2 mg/mL時(shí)，其螯合率達(dá)31.23%，可能與玉米谷蛋白的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。與玉米谷蛋白相比，糖基化改性使玉米谷蛋白Fe2+螯合能力進(jìn)一步增加，兩者螯合Fe2+的EC50值分別為2.94，1.67 mg/mL。分析可能的原因是糖基化改性使玉米谷蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，谷氨酰胺殘基上的一些配位能力較強(qiáng)的基團(tuán)例如羰基(—C═O)裸露出來(lái)，更易于與Fe2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，因此糖基化改性玉米谷蛋白可以通過(guò)螯合Fe2+來(lái)阻止Fe2+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，從而消除自由基對(duì)機(jī)體造成的氧化性損傷，與2.2.2的結(jié)果相一致。

圖7 糖基化改性和蛋白濃度對(duì)玉米谷蛋白Fe2+-螯合能力的影響Figure 7 Effect of the modification and protein content on the Fe2+-chelating capacity of corn glutelin

3 結(jié)論

玉米谷蛋白是結(jié)構(gòu)緊密、分子量巨大而復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)，其溶于稀酸堿性溶液的特性限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本試驗(yàn)利用TGase和D-氨基半乳糖對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行糖基化改性，研究了糖基化改性對(duì)玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)和抗氧化活性的影響。紅外光譜的測(cè)定結(jié)果表明，在TGase的催化下，玉米谷蛋白與D-氨基半乳糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，但結(jié)合量較低。與玉米谷蛋白相比，D-氨基半乳糖的共價(jià)結(jié)合使玉米谷蛋白的結(jié)構(gòu)變得無(wú)序而松散，熱穩(wěn)定性降低；同時(shí)，糖基化改性使玉米谷蛋白的抗氧化活性顯著提高，說(shuō)明酶法糖基化是一種適合于對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行改性的有效方法。在此基礎(chǔ)上，可以采用細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步研究糖基化玉米谷蛋白的毒性及生理功能特性，這對(duì)糖基化玉米谷蛋白能否成功應(yīng)用于食品工業(yè)具有重要意義。