王玉潯，安雅臣，蔣艷茹

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000；2唐山市中醫(yī)醫(yī)院)

腹膜透析是終末期腎臟疾病患者行腎臟替代治療的主要方式之一。腹膜結(jié)構(gòu)、功能的正常是保證腹膜透析有效性的關(guān)鍵因素。腹膜間皮細(xì)胞是腹膜組織的主要組成細(xì)胞。研究表明，長期暴露在高糖腹膜透析液中，腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腹膜纖維化，最終使腹膜功能喪失[1～3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過基因調(diào)控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。2016年10～11月，本研究分析了lncRNA與腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步闡明腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料

SPF級C57BL/6雄性小鼠20只，7～8周齡，體質(zhì)量(25±3)g，由北京實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗 ，均購自Epitomics公司(USA)。

2 方法與結(jié)果

2.2 動物分組及處理 小鼠均給予適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，隨機(jī)分為對照組和模型組，每組10只。對照組正常飼養(yǎng)4周；模型組給予4.5%高糖腹膜透析液腹腔注射，每次注射劑量為1 mL/kg，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 腹膜組織形態(tài)學(xué)觀察 模型組透析4周結(jié)束時處死兩組小鼠，取壁層腹膜組織，進(jìn)行HE染色，觀察腹膜間皮細(xì)胞及其周圍結(jié)締組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示，對照組腹膜組織呈一層致密、光滑的薄層，覆蓋一層扁平狀間皮細(xì)胞，細(xì)胞連接良好，間皮下基底膜薄，與結(jié)締組織相連，無膠原纖維組織沉積，未見毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血及炎性細(xì)胞浸潤；模型組腹膜組織薄厚不均，部分間皮細(xì)胞腫脹變形甚至脫落，纖維裸露，炎性細(xì)胞增多，膠原沉積增多，間皮下致密層增厚。提示腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。

2.4 腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化蛋白TGF-β1、E-cadherin、α-SMA表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取2.3制備的兩組小鼠臟層腹膜組織，利用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取約150 μg加樣緩沖液100 ℃沸水煮沸5 min，充分變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜(240 Ma，120 min)，5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h；分別加入TGF-β1(1∶3 000)、E-cadherin(1∶500)、α-SMA(1∶300)一抗，4 ℃搖床過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育2 h；再次洗膜，用ECL發(fā)光液在暗室進(jìn)行壓片、顯影、曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，采用圖像分析系統(tǒng)掃描確定膠片上雜交條帶的相對吸光度(A)值，進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)下降，見表1；提示轉(zhuǎn)分化模型建立成功。

表1 兩組腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 差異表達(dá)lncRNA篩選 采用芯片技術(shù)。取2.3獲得的兩組小鼠臟層腹膜組織(每組3只)，TRIzol法提取組織總RNA，用Invitrogen SuperScript ds-cDNA synthesis kit合成雙鏈cDNA，進(jìn)行熒光標(biāo)記并雜交漂洗，用Agilent芯片掃描儀(G2565CA)進(jìn)行掃描，使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)。使用Agilent Gene Spring軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析。差異篩選標(biāo)準(zhǔn)： fold>1.5 &P<0.05。上述工作均由北京博奧生物有限公司完成。根據(jù)芯片表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)果，將對照組與模型組的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較，兩組表達(dá)量比值在2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義的lncRNA共757條，2倍以上上調(diào)的共311條，2倍以上下調(diào)的共446條。同時，基因芯片也檢測了在腹膜細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中mRNA的表達(dá)譜，差異表達(dá)量比值在2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義的mRNA共1 431條，2倍以上上調(diào)的共489條，2倍以上下調(diào)的共942條。兩組表達(dá)量差異最大的前20個lncRNA見表1，表達(dá)量差異最大的前20個mRNA見表2。

表1 兩組表達(dá)量差異最大的前20個lncRNA

表2 兩組表達(dá)量差異最大的前20個mRNA

2.6 差異表達(dá)mRNA的GO功能注釋分析 根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫將差異表達(dá)mRNA按分子生物學(xué)功能、生物學(xué)過程和在細(xì)胞組件中的作用三個方面進(jìn)行功能富集，發(fā)現(xiàn)在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中，差異表達(dá)的靶基因mRNA主要參與細(xì)胞膜的固有組成、細(xì)胞周邊組織結(jié)構(gòu)組成、炎癥防御反應(yīng)等。篩選出的前4位GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見表3。

表3 差異表達(dá)lncRNA的GO功能注釋

2.7 KEGG通路分析 利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)mRNA進(jìn)行信號通路分析，觀察在腹膜纖維化過程中發(fā)生顯著變化的mRNA可能與哪些信號通路的改變有關(guān)，結(jié)果表明差異表達(dá)mRNA可能參與了真核生物翻譯過程、膜蛋白合成等途徑。篩選出的前4位生物學(xué)通路名稱及其基因數(shù)見表4。

2.8 差異lncRNA mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法對差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證。選擇差異表達(dá)倍數(shù)較大(>5倍)，長度為500～2 000 nt，表達(dá)豐度在1 000以上的2個上調(diào)的和2個下調(diào)的lncRNA即ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611、NONMMUT002253、NONMMUT064302進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。采用ABI7500PCR儀以SYBR Green熒光染料摻入法相對定量，同時以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的差異表達(dá)倍數(shù)。

表4 差異表達(dá)mRNA的KEGG通路及基因數(shù)

結(jié)果顯示，模型組NONMMUT002253、NONMMUT064302相對表達(dá)量低于對照組，ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611相對表達(dá)量高于對照組(P均<0.01)。結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致，表明芯片結(jié)果的可靠性。見表5。

表5 兩組差異表達(dá)lncRNA mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮來源的細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)性細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象[4,5]。研究表明，EMT的過程包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)和基因型改變，細(xì)胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達(dá)減少，使立方上皮細(xì)胞下調(diào)或失去細(xì)胞間相互作用；上皮細(xì)胞外形演變?yōu)樗笮卫w維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞角蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞或纖維原細(xì)胞的特性，如α-SMA、Vimtin蛋白、骨橋蛋白、Snail、slug及其他間質(zhì)特性蛋白表達(dá)上調(diào)等[6～9]。

腹膜間皮細(xì)胞是腹膜的主要組成細(xì)胞，是維持腹膜結(jié)構(gòu)完整、功能穩(wěn)定和保證腹膜透析有效性的重要因素。腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT被認(rèn)為是腹膜纖維化的始動環(huán)節(jié)[10,11]，其發(fā)生的初期是一個可逆的過程。早期干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、防止腹膜纖維化及保護(hù)腹膜透析患者的腹膜功能是目前研究的重點(diǎn)。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，隨著全基因組分析技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA可作為人類基因組中一類重要的表觀遺傳調(diào)控因子，以RNA形式通過表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面調(diào)控DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)，最終調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)及翻譯[12～16]，廣泛參與細(xì)胞分化、增殖和代謝，參與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展[17～19]。目前關(guān)于lncRNA與EMT的關(guān)系及其在腫瘤領(lǐng)域的重要性備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的調(diào)控作用具有組織特異性，在不同腫瘤調(diào)控中發(fā)揮不同的作用。lncRNA可通過調(diào)控 EMT過程對細(xì)胞間連接和黏附進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過抑制EMT或促進(jìn)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)分化(MET)過程抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生[20～23]。

本研究借助芯片技術(shù)篩選出了與腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的lncRNA及其下游靶基因mRNA的差異表達(dá)譜，并利用RT-PCR技術(shù)，對表達(dá)差異最為顯著的4個lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與芯片技術(shù)結(jié)果相一致，證明芯片結(jié)果的可靠性。

本研究首次在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面提出了lncRNA參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的病理生理過程。通過高通量微陣列芯片技術(shù)證實(shí)lncRNA參與了腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步分析驗(yàn)證差異表達(dá)lncRNA的分子生物功能及其靶基因，進(jìn)一步闡明lncRNA在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用，從而為臨床防治腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化提供理論依據(jù)。