林高陽，高大登，袁方，劉振波

(青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定基因或DNA片段的方法，已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如基因分離、克隆、核酸序列分析、胎兒性別鑒定、癌癥治療監(jiān)控、基因突變檢測(cè)等。近年來，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/SMAD信號(hào)通路及SMAD基因家族與各種疾病的研究不斷升溫，SMAD基因家族的PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用也更加廣泛。引物設(shè)計(jì)是影響PCR試驗(yàn)的重要參數(shù)之一，一對(duì)高度有效的基因引物序列可以更好地檢測(cè)基因表達(dá)變化。目前，雖然引物設(shè)計(jì)軟件的功能趨于完善，但關(guān)于計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)程序的文獻(xiàn)還不多。2017年1～12月，本研究以SMAD基因家族引物設(shè)計(jì)為例，對(duì)引物設(shè)計(jì)原則和軟件引物設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行了分析，同時(shí)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SMAD基因家族在人正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B和非小細(xì)胞肺癌A549、SK-MES-1、H1299中的表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步研究SMAD基因提供條件。

1 材料

人正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B，肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299，肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection. ATCC，Manassas, VA, USA)；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自TaKaRa生物科技公司；SMAD基因家族引物自主設(shè)計(jì)，堿基序列由華大生物科技有限公司合成，應(yīng)用Applied Biosystems(ABI)7900 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行檢測(cè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 SMAD基因家族(SMAD1～SMAD8)特異引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證 在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索SMAD1～SMAD8基因序列，應(yīng)用Premier Primer5.0軟件，按照引物設(shè)計(jì)的基本原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)流程：獲取SMAD基因序列(NCBI、Gramene、EBI等)；序列編輯與整理(明確SMAD家族成員的可變剪切體數(shù)目)；確定引物設(shè)計(jì)的位置蛋白質(zhì)編碼(CDS)區(qū)；引物特異比對(duì)及綜合評(píng)價(jià)(BLAST、Oligo6.0等)；引物合成；PCR擴(kuò)增試驗(yàn)驗(yàn)證(擴(kuò)增曲線、溶解曲線、凝膠成像等)。SMAD1～8基因分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，引物序列見表1。引物驗(yàn)證結(jié)果見圖1、2。通過對(duì)SMAD基因家族引物進(jìn)行上述驗(yàn)證，確定SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2引物的擴(kuò)增效率更高、特異性更強(qiáng)。

表1 SMAD基因家族PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2.2 SMAD1～SMAD8在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)變化 將人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞采用Keratinocyte Supplementary Free Medium培養(yǎng)基在，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育培養(yǎng)。人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1用含有10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。應(yīng)用TRIzol法提取各細(xì)胞的總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶按照Takara試劑盒使用說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。所得cDNA置于-20 ℃保存。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞SMAD1～SMAD8 mRNA表達(dá)，所選引物分別為SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2。

圖1 SMAD基因家族引物PCR擴(kuò)增曲線

圖2 SMAD基因家族引物PCR溶解曲線

以正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞中SMAD1表達(dá)量為基準(zhǔn)(校正RQ約為1)，SMAD2相對(duì)表達(dá)量為6.590±0.459、SMAD3為10.977±0.312、SMAD4為4.651±0.115、SMAD5為16.762±0.389、SMAD6為3.248±0.108、SMAD7為2.007±0.012、SMAD8為1.144±0.103，均較SMAD1表達(dá)升高，其中SMAD5表達(dá)最高，SMAD3次之。由此可以推測(cè)，SMAD5、SMAD3在正常支氣管上皮細(xì)胞中可能具有維持細(xì)胞生物學(xué)穩(wěn)定的功能。

SMAD2、SMAD4、SMAD5、SMAD6、SMAD7、SMAD8在肺腺癌A549、H1299細(xì)胞及肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞中的表達(dá)均較人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞降低；在H1299、SK-MES-1細(xì)胞中SMAD1表達(dá)較BEAS-2B和A549細(xì)胞增加，且在A549細(xì)胞中SMAD1表達(dá)較BEAS-2B細(xì)胞下降；在SK-MES-1細(xì)胞中SMAD3表達(dá)增加，且在H1299、A549細(xì)胞中SMAD3表達(dá)較BEAS-2B細(xì)胞下降；在H1299細(xì)胞中SMAD2、SMAD6、SMAD7表較其他三種細(xì)胞均下降；各細(xì)胞間比較P<0.05或<0.01。見表2。

表2 各種細(xì)胞中SMAD1～ SMAD8表達(dá)

3 討論

PCR又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性及敏感性高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。PCR擴(kuò)增時(shí)需要引物。在準(zhǔn)備設(shè)計(jì)基因引物前，要清楚地認(rèn)識(shí)實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義，通過查閱文獻(xiàn)，明確該基因的相關(guān)研究理論；明確是否要進(jìn)一步用于克隆或表達(dá)。如果需要克隆，引物5′端最好加上限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，加入的酶切位點(diǎn)不能與引物內(nèi)部形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，并且所選擇的酶切位點(diǎn)盡量為多克隆位點(diǎn)的中間酶切位點(diǎn)，且載體的其他位置應(yīng)盡量無該酶切位點(diǎn)。如此構(gòu)建新的質(zhì)粒時(shí)可供選擇的內(nèi)切酶空間更大，并保證所需擴(kuò)增的DNA序列中無該酶切位點(diǎn)，為日后研究該基因的后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。目前，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)模板選擇有兩種情況：一種是擴(kuò)增已知基因，需要在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中搜索相同物種該基因的DNA或者mRNA作為模板來設(shè)計(jì)引物；另一種是擴(kuò)增未知基因，需根據(jù)比較基因組定位的原理，選擇研究深入的高等動(dòng)植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列為模板來設(shè)計(jì)引物。雖然引物設(shè)計(jì)模板選擇有很多種，但是無論何種情況，都要涉及引物設(shè)計(jì)軟件。當(dāng)前進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的國際三大核酸數(shù)據(jù)庫分別為NCBI、DDBJ、EMBL，生物軟件有BlockMaker、CodeHop、clustalW2、VectorNTISuit、Dnasis Omiga、Dnastar、DNAMAN、Oligo6.0等[1]。設(shè)計(jì)引物的軟件一般均具有引物自動(dòng)搜索功能，不同軟件側(cè)重點(diǎn)有所不同，自動(dòng)搜索的結(jié)果也不同。一般以Premier Primer5.0功能最強(qiáng)且方便使用，其次是Oligo6.0。要想得到效果好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。本研究中我們采用以上方法成功設(shè)計(jì)出SMAD基因家族引物序列，通過對(duì)引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，根據(jù)溶解曲線、擴(kuò)增曲線及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析，選擇在相同溫度下，擴(kuò)增曲線擬合度較一致且曲線定點(diǎn)斜率大，表示擴(kuò)增效率高、特異性好的引物序列；溶解曲線擬合度較一致且溶解溫度穩(wěn)定，溶解曲線峰值較高，表示引物和擴(kuò)增片段間能夠很快解鏈并能夠很快結(jié)合擴(kuò)增，進(jìn)而更能實(shí)現(xiàn)特異引物與目的基因模板序列間高效和特異擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的一種檢測(cè)方法，根據(jù)目的片段基因CDS區(qū)堿基對(duì)的大小，可通過瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)擴(kuò)增片段的條帶是否為我們所設(shè)計(jì)的目的基因片段，條帶亮度也能判定擴(kuò)增的目前基因的數(shù)量，間接反映擴(kuò)增效率。結(jié)合以上設(shè)計(jì)分析過程，本研究成功設(shè)計(jì)并鑒定出擴(kuò)增效率高、特異性高的針對(duì)目的基因SMAD基因家族的引物序列。

TGF-β/SMAD信號(hào)通路是一條重要的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TGF-β是一種重要的細(xì)胞因子，廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、形態(tài)改變、黏附、轉(zhuǎn)移及凋亡。TGF-β超家族成員通過膜受體介導(dǎo)將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，其下游最主要的信號(hào)蛋白SMAD在細(xì)胞內(nèi)通過不同的方式參與各種基因的表達(dá)調(diào)控。SMAD是將TGF-β信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵分子，參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌、凋亡等一系列生物學(xué)功能。但目前TGF-β/SMAD信號(hào)通路在肺癌中的作用尚不十分清楚，SMAD基因家族在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)變化及主要功能目前尚未見報(bào)道。

SMAD蛋白是在小鼠與人類細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一類蛋白質(zhì)[2]，因果蠅中相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)名為Mad而得名。人SMAD基因位于15q22.31-q23及18q21.1染色體區(qū)域，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SMAD蛋白家族包括SMAD1～9[3]。根據(jù)SMAD蛋白結(jié)構(gòu)和功能不同可分為三類[4]：第一類是受體調(diào)節(jié)型SMAD蛋白(RR-SMAD)，是TGF-β家族受體激酶的直接底物；包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8、SMAD9。其中SMAD2、SMAD3分子C-末端具有特征性絲氨酸序列，可被活化的TRI磷酸化，決定了配體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性，是參與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)分子。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織SMAD2基因高表達(dá)會(huì)影響患者預(yù)后[5]；SMAD2蛋白對(duì)TGF-β1/SMAD3介導(dǎo)的肝纖維化具有保護(hù)作用[6]。第二類為共同調(diào)節(jié)型SMAD 蛋白(Co-SMAD)即SMAD4，可通過受體磷酸化的SMAD蛋白參與TGF-β、活化素和BMP的信號(hào)傳導(dǎo)[7]。Co-SMAD是TGF-β/SMAD信號(hào)通路信息傳遞的共用分子[8]，在參與和調(diào)節(jié)TGF-β超家族后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面必不可少。對(duì)于上皮組織起源的細(xì)胞，SMAD4蛋白核移位可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)于控制細(xì)胞的增殖可能起重要作用。由于SMAD4蛋白的C-端缺乏SSXS motif結(jié)構(gòu)，SMAD4蛋白不結(jié)合也不受TGF-β刺激而發(fā)生磷酸化，但可結(jié)合或穩(wěn)定其他SMAD復(fù)合體[9]，因此SMAD4是具有協(xié)同作用的蛋白，SMAD2、SMAD3與SMAD4 可協(xié)同誘導(dǎo)TGF-β并刺激其他基因的表達(dá)；同時(shí)將SMAD2與SMAD4的C-端截除得到的蛋白質(zhì)則是TGF-β信號(hào)傳遞的抑制劑；另外研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4也是腫瘤抑制候選基因，在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)異常[10～12]。第三類是抑制型SMAD蛋白(I-SMAD)，包括SMAD6、SMAD7。SMAD7與SMAD泛素化調(diào)節(jié)因子(Smurf)共同參與SMAD4降解[13]；可募集Smurf至TGF-β受體，誘導(dǎo)TGF-β受體的降解，進(jìn)而抑制TGF-β/SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)[14]。SMAD7基因位于染色體18q21，屬于抑制型SMAD，不能被受體磷酸化，但可與活化的TGF-β受體1牢固結(jié)合，阻止RR-SMAD磷酸化，從而對(duì)該超家族信號(hào)傳遞起負(fù)調(diào)控作用。SMAD7表達(dá)紊亂可影響細(xì)胞對(duì)TGF-β的應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，在成人T細(xì)胞白血病和淋巴瘤中SMAD7表達(dá)上調(diào)[15]；在胃癌和甲狀腺癌中也發(fā)現(xiàn)SMAD7表達(dá)上調(diào)[16,17]；提示SMAD7表達(dá)異?？纱龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B，肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299及肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1中SMAD基因家族表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肺支氣管上皮細(xì)胞中SMAD2、SMAD3、SMAD5基因高表達(dá)，SMAD5表達(dá)最高；在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，肺腺癌A549細(xì)胞中SMAD基因家族表達(dá)情況較正常支氣管上皮細(xì)胞SMAD基因家族表達(dá)水平普遍偏低，以SMAD5、SMAD8降低最為明顯；上述結(jié)果提示，SMAD5可能在肺腺癌A549癌性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在肺腺癌H1299、肺鱗癌SK-MES-1中同樣發(fā)現(xiàn)SMAD5低表達(dá)，提示SMAD5可能參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。在肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞系中SMAD3高表達(dá)，而在正常支氣管上皮中SMAD3已存在相對(duì)高表達(dá)，提示SMAD3可能與上皮相關(guān)性疾病相關(guān)。上述結(jié)果提示，SMAD基因家族在不同細(xì)胞系尤其是正常細(xì)胞和癌性細(xì)胞系中的表達(dá)變化具有明顯的不同；在不同病理類型的肺癌細(xì)胞系中，SMAD基因表達(dá)變化與病理類型具有相關(guān)性。

本研究初步明確了人正常肺支氣管上皮細(xì)胞向癌癥方向發(fā)生、發(fā)展中變化明顯的SMAD基因，為后續(xù)深入研究TGF-β/SMAD信號(hào)通路、肺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵SMAD基因以及TGF-β/SMAD信號(hào)通路在肺癌發(fā)生中的具體作用提供了方向，也為Primer Bank引物序列數(shù)據(jù)庫填補(bǔ)了檢測(cè)SMAD基因家族的高效特異引物序列。