何泳志，李大文，成俊萍，潘琪

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021)

近年來(lái)梗阻性無(wú)精子癥(OA)的發(fā)病率逐年升高。OA多為炎性梗阻，炎癥反應(yīng)致精子質(zhì)量下降可能是其妊娠率低的原因之一。卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(ICSI)是目前治療OA的主要方法，但妊娠率僅為30%～50%[1]。目前國(guó)內(nèi)大部分生殖中心對(duì)OA患者行ICSI助孕前不給予藥物干預(yù)，藥物干預(yù)對(duì)OA患者行ICSI治療后妊娠結(jié)局的影響鮮見報(bào)道。脂質(zhì)代謝參與精子與卵母細(xì)胞結(jié)合，并影響胚胎質(zhì)量。左卡尼汀具有抗氧化作用，可調(diào)控脂質(zhì)代謝，改善精子質(zhì)量。本研究探討OA患者ICSI助孕前給予左卡尼汀干預(yù)對(duì)妊娠結(jié)局影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1～11月我院收治的OA患者及其配偶136對(duì)，男方年齡(28.43±2.19)歲，睪酮(524.35±91.37)ng/dL，F(xiàn)SH(7.29±2.28)IU/L，睪丸體積(29.94±2.03)mL；女方生殖功能均良好，年齡(27.53±2.32)歲，獲卵數(shù)(10.31±3.59)個(gè)，左側(cè)竇卵泡數(shù)(7.25±1.29)個(gè)、右側(cè)竇卵泡數(shù)(7.18±1.24)個(gè)。OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)3次或3次以上精液常規(guī)檢查并經(jīng)過(guò)離心后確認(rèn)，精子數(shù)均為0；FSH基本正常；睪丸活檢中存在精子；睪丸體積>30 mL或單側(cè)體積>15 mL。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合OA診斷標(biāo)準(zhǔn)；男性年齡20～40歲，女性年齡20～38歲；女方月經(jīng)來(lái)潮2～4天查性激素及B超檢查竇卵泡情況示卵巢功能正常；女方通過(guò)長(zhǎng)方案超促排卵取出卵子>5個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫婦雙方近期高熱或有手術(shù)麻醉史；具有家族遺傳病史或染色體異常；具有吸煙、酗酒或吸毒等不良嗜好；患有不宜生育的疾病。將研究對(duì)象隨機(jī)分為干預(yù)組71對(duì)和對(duì)照組65對(duì)，兩組男女雙方基本資料均具有可比性。

1.2 治療方法 干預(yù)組OA患者服用左卡尼汀口服液1.0 g，2次/d；對(duì)照組不給予任何藥物。連續(xù)服藥3個(gè)月結(jié)束時(shí)，在女方取卵當(dāng)天所有OA患者均行經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA)取精、ICSI助孕。具體方法：①促排卵和采卵：兩組女方均行控制性促排卵和采卵。促排卵采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案，即從前一個(gè)月經(jīng)周期21日起皮下注射GnRH-a行降調(diào)節(jié)，當(dāng)達(dá)到降調(diào)節(jié)的相關(guān)指標(biāo)后，增用促性腺激素(Gn)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育。如果有2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm，停止使用GnRH-a和Gn，根據(jù)患者具體情況當(dāng)晚肌注人絨毛膜促性腺激素(HCG)，給藥36 h于手術(shù)室在陰道B超引導(dǎo)下行經(jīng)陰道超聲穿刺取卵。將獲得的卵母細(xì)胞放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h以備行ICSI。卵母細(xì)胞受精前于顯微鏡下觀察其成熟情況，處在分裂中期Ⅱ(MⅡ)的卵細(xì)胞視為成熟卵細(xì)胞。②PESA：OA患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾。采用5 mL注射器吸入少量培養(yǎng)液，直視下用4號(hào)半針頭經(jīng)皮穿刺附睪，負(fù)壓抽吸至有淡黃色渾濁液體抽出。如未見液體被抽出，可改變穿刺方向重復(fù)抽吸。將抽吸出的液體注入含精子洗滌液的培養(yǎng)皿，于倒置顯微鏡下尋找并取出活動(dòng)的成熟精子。③ICSI：取MⅡ期的成熟卵細(xì)胞行單精子顯微注射。注射后16～18 h觀察受精情況，48 h觀察卵裂情況，48～72 h選取優(yōu)質(zhì)胚胎由生殖醫(yī)生行胚胎移植。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 精子DNA斷裂率(DFI)、頂體完整率及自發(fā)頂體反應(yīng)率 分別于治療前及給藥3個(gè)月結(jié)束、女方取卵當(dāng)天對(duì)OA患者行睪丸活檢并取出精子，檢測(cè)精子DNA完整率、精子頂體完整率及精子自發(fā)頂體反應(yīng)率。精子DFI檢測(cè)：采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)。將獲得的精子接種于4孔皿，接種密度為5×105個(gè)/mL。隨機(jī)計(jì)數(shù)400個(gè)精子觀察精子光暈大小。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無(wú)光暈4個(gè)等級(jí)，大和中光暈表示精子DNA完整無(wú)碎片，小和無(wú)光暈表示精子DNA斷裂為碎片。判斷標(biāo)準(zhǔn)：精子頭直徑≤1/4為小光暈，1/4<精子頭直徑≤2/3為中光暈，精子頭直徑>2/3為大光暈。以精子DFI表示精子DNA完整率。精子頂體完整率及精子自發(fā)頂體反應(yīng)率檢測(cè)：將獲得的精子置于450～490 nm激發(fā)光下于400倍油鏡下觀察，判斷精子頂體完整性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：頂體完整：精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻；頂體反應(yīng)：精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶，或者在頂體區(qū)根本沒(méi)有熒光染色；頂體異常：除上述兩類精子外的所有其他精子。隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算精子頂體完整率及精子自發(fā)頂體反應(yīng)率。

1.3.2 受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率 行ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。行ICSI第3天遵循Peter分級(jí)原則選擇優(yōu)質(zhì)胚胎(Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí))或囊胚進(jìn)行移植，胚胎移植的數(shù)量不超過(guò)3個(gè)，其他Ⅱ級(jí)以上胚胎經(jīng)患者知情同意后凍存，剩余胚胎經(jīng)患者同意后予以醫(yī)學(xué)丟棄，在此過(guò)程中女方給予黃體酮支持。移植術(shù)后14天若女方血β-HCG為陽(yáng)性，則在移植術(shù)后第35天進(jìn)行B超觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目和胎心搏動(dòng)以判斷是否臨床妊娠。統(tǒng)計(jì)女方受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率。受精率=正常受精數(shù)/獲卵數(shù)×100%；卵裂率=正常卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 兩組OA患者精子DFI、頂體完整率及自發(fā)頂體反應(yīng)率比較 干預(yù)組治療后精子DFI及自發(fā)頂體反應(yīng)率均低于治療前及對(duì)照組治療后，精子頂體完整率均高于治療前及對(duì)照組治療后，組間及組內(nèi)比較P均<0.01；對(duì)照組治療前后三項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組OA患者精子DFI、頂體完整率及自發(fā)頂體反應(yīng)率比較

注：與同組治療前比較，*P<0.01；與對(duì)照組治療后比較，△P<0.01。

2.2 兩組女方受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率比較 干預(yù)組共獲得748個(gè)卵子，正常受精卵679個(gè)，正常卵裂胚胎672個(gè)，優(yōu)質(zhì)胚胎311個(gè)，臨床妊娠33例；對(duì)照組共獲得663個(gè)卵子，正常受精卵557個(gè)，正常卵裂胚胎550個(gè)，優(yōu)質(zhì)胚胎195個(gè)，臨床妊娠23例。干預(yù)組受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于對(duì)照組(P均<0.01)，兩組卵裂率、臨床妊娠率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 兩組女方受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率比較(%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

3 討論

OA在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是造成難治性男性不育的原因之一。ICSI技術(shù)的成功應(yīng)用使廣大OA患者實(shí)現(xiàn)了生育愿望[4]。生殖系統(tǒng)炎癥如陰囊炎、附睪炎、精囊炎、睪丸炎、前列腺炎等均可能導(dǎo)致精路梗阻，慢性附睪炎可導(dǎo)致附睪纖維化、功能喪失，長(zhǎng)期梗阻淤積導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，抑制附睪內(nèi)精子發(fā)育成熟；附睪內(nèi)炎性物質(zhì)、淤血及組織碎片等均會(huì)導(dǎo)致精子損傷。因此OA患者附睪精子質(zhì)量較正?；颊哂兴陆礫5,6]。但OA患者附睪精子質(zhì)量下降這種情況在人類輔助生殖過(guò)程中尚未引起生殖科醫(yī)師的重視，目前大多數(shù)生殖中心對(duì)于OA患者行ICSI助孕前不予藥物進(jìn)行干預(yù)。

卡尼汀又稱肉毒堿或肉堿，在人體內(nèi)可以通過(guò)自身合成滿足生理代謝的需求?？嵬∮腥N光學(xué)旋光體，即右旋D型、左旋L型及外消旋化DL型，惟有左旋L型卡尼汀即左卡尼汀具有生理活性。左卡尼汀可競(jìng)爭(zhēng)性抑制肉堿脂肪酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)活性和肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性，阻礙人類細(xì)胞的脂肪代謝過(guò)程[7]，在卵母細(xì)胞成熟、精卵結(jié)合過(guò)程和胚胎培養(yǎng)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[7,8]。精子頂體質(zhì)量是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的常用指標(biāo)[9]。評(píng)價(jià)精子頂體是否缺陷的主要指標(biāo)包括精子頂體完整率及精子頂體酶水平。男性不育的重要原因之一就是精子頂體缺陷導(dǎo)致頂體不完整[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，精子頂體基質(zhì)可以發(fā)揮支架作用，當(dāng)精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)可以釋放及控制與精子頂體相關(guān)的蛋白質(zhì)。精子頂體基質(zhì)位于精子頭部，可以和卵母細(xì)胞周圍的透明帶進(jìn)行相互作用，當(dāng)精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)即使相關(guān)蛋白被水解，精子頂體還能繼續(xù)保持穩(wěn)定性。在受精過(guò)程中發(fā)生頂體反應(yīng)是一個(gè)基本步驟，頂體膜和細(xì)胞質(zhì)膜混合形成的囊泡在細(xì)胞外釋放頂體酶，頂體酶覆在精子頭部，并使精子穿透卵母細(xì)胞進(jìn)行受精[11,12]。

本研究對(duì)OA患者在行ICSI助孕前應(yīng)用左卡尼汀進(jìn)行干預(yù)，3個(gè)月后采用PESA取出附睪精子行ICSI助孕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)組OA患者精子DNA完整率與精子頂體完整率均高于對(duì)照組，精子頂體自發(fā)反應(yīng)率顯著低于對(duì)照組。提示左卡尼汀可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用改善精漿內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)相關(guān)蛋白表達(dá)，有利于改善精子能動(dòng)性；左卡尼汀應(yīng)用于OA患者可以改善其附睪精子染色質(zhì)的質(zhì)量，提高精子DNA完整性。由于精子頂體不完整、頂體酶缺陷及精漿內(nèi)存在氧化應(yīng)激的環(huán)境導(dǎo)致精子在未受精前發(fā)生頂體反應(yīng)，進(jìn)而影響精子受精和精卵融合；左卡尼汀具有抗氧化應(yīng)激等作用，可提高精子的頂體完整性，繼而降低精子頂體自發(fā)反應(yīng)[13]。本研究中干預(yù)組女方受精率與優(yōu)質(zhì)胚胎率優(yōu)于對(duì)照組，提示左卡尼汀可能通過(guò)提高OA患者附睪精子的功能及質(zhì)量包括精子能動(dòng)性、精子DNA完整性及頂體完整性等提高受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率。

綜上所述，OA患者行ICSI前給予藥物輔助治療可提高精子質(zhì)量，改善臨床妊娠結(jié)局。