魏淑琴，趙曉莉，梁霞，劉婷， 肖吉業(yè)

(1青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033；2青島市職業(yè)教育公共實(shí)訓(xùn)基地)

機(jī)體感染HBV后，大多數(shù)病毒能夠被清除，但部分患者發(fā)展成慢性肝炎、重度肝炎、肝硬化，甚至出現(xiàn)原發(fā)性肝癌[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體的免疫功能在肝炎發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，不同細(xì)胞因子之間互相作用，影響機(jī)體的防御機(jī)制[4]。IL-15作為一種多功能細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞和組織中，調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫，與HBV感染緊密相關(guān)[5]。恒定自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)是自然殺傷細(xì)胞的亞群，影響抗HBV的復(fù)制過(guò)程[6]。本研究探討HBV感染者血清IL-15、外周血iNKT水平變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月～2017年9月青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)收治的HBV感染者87例，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)》的標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中男52例、女25例，年齡28～45(33.12±6.08)歲，BMI 20.17～24.39(22.26±1.72)；慢性乙型肝炎35例(慢乙肝組)，慢性HBV攜帶者52例(HBV攜帶組)；免疫清除期(血清HBsAg、HbeAg、HBV DNA陽(yáng)性，肝組織學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示有肝炎)30例，免疫耐受期(血清HBsAg、HbeAg、HBV DNA陽(yáng)性，血清ALT和AST正常，肝組織學(xué)結(jié)果無(wú)異常)57例；按照2000年《病毒性肝炎防治指南》慢性乙型肝炎病情分類標(biāo)準(zhǔn)[8]：輕度15例，中度11例，重度9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：① HBV DNA陽(yáng)性；②入組前未接受護(hù)肝治療；③入組前1年內(nèi)未服用免疫調(diào)節(jié)劑；④臨床資料完整，治療依從性高；⑤患者及其家屬對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型的肝炎病毒感染；②酒精性肝炎、潰瘍性腸炎、自身免疫性肝炎等；③合并心、腎等重大臟器病變。另選同期體檢健康者50例為對(duì)照組，其中男36例、女24例，年齡28～47(33.25±6.11)歲，BMI 20.09～24.26(22.13±1.56)。兩組性別、年齡、BMI具有可比性。

1.2 血清IL-15、ALT、AST、總膽紅素(TBil)檢測(cè) 所有研究對(duì)象抽取空腹肘靜脈血4 mL，置于未涂有肝素鈉的采血管中，室溫下靜置20 min，以3 500 r/min離心10 min，分離血清。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清IL-15水平，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。應(yīng)用AU-680全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST和TBil水平。

1.3 外周血iNKT檢測(cè) 所有研究對(duì)象抽取空腹肘靜脈血4 mL，制備新鮮肝素鈉抗凝血，將抗凝血與30 mL健康人濃縮白細(xì)胞進(jìn)行混懸，再用34 mL生理鹽水稀釋，將等體積淋巴細(xì)胞分離液緩慢加入到上述混合液中，以800 g速度離心20 min，分離中間的單核細(xì)胞層，加入磷酸鹽緩沖液；分別以800 g和400 g速度離心15 min和5 min，分離沉淀，獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。取400 μL PBMC混懸液，依次加入PMA(1:100)10 μL、BFA(1:10)8 μL和Ionomycin(1:20)8 L，置于培養(yǎng)箱孵育4 h；清洗PBMC并離心，磷酸鹽緩沖液100 μL重懸；加入CD3-Per-CP-Cy5-5、TCRVα24-FITC及TCRVβ11-PE各5 μL，室溫下避光孵育30 min，固定并破膜；加入磷酸鹽緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，加入5 μL IFN-γ-PE-Cy7、5 μL TNF-α-APC及5 μL IL-4-APC，室溫下避光孵育30 min；使用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞400 μL，采用貝克曼庫(kù)爾特Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+T細(xì)胞中的iNKT，計(jì)算其比例(外周血iNKT比例)，以及分泌IFN-γ、TNF-α及IL-4的iNKT細(xì)胞在總iNKT細(xì)胞中的比例(簡(jiǎn)寫為IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例)。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：熒光標(biāo)記結(jié)果中CD3+T細(xì)胞為黃綠色，iNKT為紅色，IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT分別為藍(lán)色、綠色及橙紅色。

2 結(jié)果

2.1 各組血清指標(biāo)及外周血各種iNKT比例比較 見表1。

表1 各組血清指標(biāo)及外周血各種iNKT比例比較

注：與對(duì)照相比較，*P<0.05；與HBV攜帶組比較，#P<0.05。

2.2 不同病情程度慢性肝炎患者各指標(biāo)比較 隨著慢性肝炎病情的加重，患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平逐漸升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例逐漸降低，組間比較P均<0.05。見表2。

表2 不同病情程度慢性肝炎患者血清指標(biāo)及外周血各種iNKT比例比較

注：與輕度比較，*P<0.05；與中度比較，#P<0.05。

2.3 不同免疫期慢性HBV感染患者各指標(biāo)比較 與免疫耐受期慢性HBV感染患者相比，免疫清除期患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均下降，組間比較P均<0.05。見表3。

表3 不同免疫期慢性HBV感染患者血清指標(biāo)及外周血各種iNKT比例比較

注：與耐受期比較，*P<0.05。

2.4 慢性HBV感染患者血清IL-15、外周血iNKT與其他指標(biāo)的相關(guān)性 慢性HBV感染患者血清IL-15水平與外周血iNKT及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與血清ALT、AST及TBil水平均呈正相關(guān)(P均<0.05)；外周血iNKT與IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT均呈正相關(guān)(P均<0.05)，與血清ALT、AST及TBil水平均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。見表4。

表4 慢性HBV感染患者血清IL-15、外周血iNKT比例與其他指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

HBV感染機(jī)體后是否可被徹底清除、是否轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，很大程度上取決于個(gè)體的免疫水平[9,10]。病毒的復(fù)制過(guò)程是免疫應(yīng)答的重要影響因素，慢性HBV感染的過(guò)程一般由免疫耐受的高感染狀態(tài)轉(zhuǎn)化為免疫清除的低感染狀態(tài)[9]。乙肝患者肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)是免疫細(xì)胞影響肝組織的結(jié)果[11,12]。HBV感染者細(xì)胞免疫應(yīng)答能力持續(xù)下降，HBV感染機(jī)體后并不會(huì)損傷肝臟，而是通過(guò)免疫反應(yīng)間接對(duì)肝臟造成損傷，多種細(xì)胞因子構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)相互影響，加重病理?yè)p傷[13,14]。

IL-15是由Grabstein等[15]在1994年發(fā)現(xiàn)的多效細(xì)胞因子，由單核/巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，屬于螺旋細(xì)胞因子家族，其生物學(xué)功能豐富，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，對(duì)機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫過(guò)程發(fā)揮重要作用。IL-15是重要的抗病毒細(xì)胞因子，來(lái)源豐富，在多種組織中均有表達(dá)，在感染性疾病、血液疾病等的免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用，在抗腫瘤和器官移植方面也有一定作用[9,16]。肝臟是人體最大的免疫器官，其中iNKT數(shù)量豐富。iNKT具有自然殺傷細(xì)胞核T淋巴細(xì)胞功能，廣泛分布在肝、脾、骨髓和外周血中，具有雙向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用，可用于抑制自身免疫性疾病、感染性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。

本研究中不同類型慢性HBV感染者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明顯高于對(duì)照組，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均低于對(duì)照組，與張?chǎng)蔚萚17]的研究結(jié)果基本一致。慢性HBV感染者iNKT數(shù)量下降，說(shuō)明機(jī)體感染慢性HBV后，iNKT出現(xiàn)耗竭和增殖能力受損[11]。隨著慢性肝炎病情的加重，慢性肝炎患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明顯升高，而外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均顯著下降，提示血清IL-15水平升高可抑制宿主抗HBV的免疫活性，導(dǎo)致HBV在機(jī)體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和表達(dá)，引發(fā)肝臟發(fā)生慢性損傷。在免疫應(yīng)答早期，HBV復(fù)制水平升高，肝內(nèi)存在大量的復(fù)制型病毒，隨著病情的加重，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞破壞感染的肝細(xì)胞，降低病毒復(fù)制水平[9]。與免疫耐受期患者相比，免疫清除期患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明顯升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均顯著下降，提示血清IL-15和外周血iNKT水平可反映慢性HBV患者的免疫狀態(tài)。

研究證實(shí)，IL-15可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及受體的誘導(dǎo)劑，T淋巴細(xì)胞只能在獲得性免疫過(guò)程中被激活，發(fā)生于機(jī)體免疫反應(yīng)的晚期，IL-15誘發(fā)的細(xì)胞免疫啟動(dòng)局部炎癥反應(yīng)[9]，IL-15作為重要的促炎因子，可上調(diào)多種免疫細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)，加重肝臟的炎癥損傷及功能性破壞[18]。機(jī)體感染HBV后，激活肝臟內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞，增加IL-15的釋放量，而高水平的IL-15刺激免疫活性細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等分泌大量的炎癥因子，同時(shí)通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用參與自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷[18]。iNKT亞群不同，分泌的細(xì)胞因子不同，活化的iNKT通過(guò)分泌IFN-γ，阻滯HBV的復(fù)制過(guò)程[17]。慢性HBV感染者血清IL-15和外周血iNKT與分泌各種細(xì)胞因子的iNKT及生化指標(biāo)密切相關(guān)，如IL-15促進(jìn)胸腺NKT前體細(xì)胞分化為終末效應(yīng)NKT，IL-15基因缺陷下調(diào)成熟NKT的功能。腫瘤動(dòng)物模型中NKT功能被抑制，過(guò)度表達(dá)的IL-15顯著提高NKT的抗腫瘤活性[18]。活化的iNKT分泌多種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-4，激活自然殺傷細(xì)胞，并通過(guò)穿孔素-顆粒酶途徑、Fas/Fas L途徑殺傷靶細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染患者血清IL-15水平與外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈負(fù)相關(guān)，與血清ALT、AST及TBil水平均呈正相關(guān)；外周血iNKT比例與IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈正相關(guān)。提示IL-15、iNKT及其分泌的細(xì)胞因子相互作用，共同促進(jìn)慢性HBV感染者的疾病進(jìn)程。

綜上所述，慢性HBV感染者血清IL-15水平升高，外周血iNKT數(shù)量下降，二者的水平變化與患者者病情及免疫狀態(tài)密切相關(guān)。