方天逸，王宇夫，林軒，王浩，崔云甫

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150001)

近年來，表觀遺傳學(xué)關(guān)于胰腺癌的研究取得了巨大進(jìn)步，“炎癌轉(zhuǎn)化”假說已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[1]。腫瘤組織中的炎性細(xì)胞，特別是嗜中性粒細(xì)胞是目前研究的熱點(diǎn)[2]。學(xué)者們致力于尋找與嗜中性粒細(xì)胞高度相關(guān)，甚至可在一定程度上代表腫瘤組織內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞募集程度的基因。慢性中性粒細(xì)胞白血病是一種以血液中嗜中性粒細(xì)胞惡性增多為主的疾病，主要由粒細(xì)胞集落刺激因子3受體(CSF3R)基因突變導(dǎo)致[3]。CSF3R不僅在骨髓中高表達(dá)，在膽囊、肺臟、膀胱、腎臟等組織也被檢測到不同程度的表達(dá)[4]。目前CSF3R基因在實(shí)體腫瘤中作用的研究剛剛起步。2017年12月～2018年2月，本研究通過公開數(shù)據(jù)庫GEO中的芯片數(shù)據(jù)，利用R2平臺，采用生物信息學(xué)技術(shù)方法分析了CSF3R與胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者總體生存率的關(guān)系，并分析其相關(guān)的作用機(jī)制和信號通路，旨在為進(jìn)一步深入研究CSF3R基因與胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載基因表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)集GSE21501，此數(shù)據(jù)集包含CSF3R表達(dá)數(shù)據(jù)的人類胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌表達(dá)譜，包括132例份胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者的癌組織標(biāo)本(30例份標(biāo)本無生存資料)，分別來自北卡羅來納大學(xué)教堂山分校、西北大學(xué)紀(jì)念醫(yī)院、北岸大學(xué)、內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心和霍普金斯醫(yī)療機(jī)構(gòu)等醫(yī)療機(jī)構(gòu)。其中原發(fā)性胰腺癌117例，轉(zhuǎn)移性胰腺癌15例。T分期：T1期2例，T2期18例，T3期90例，T4期2例；N分期：N0期34例，N1期81例；M分期：M0期116例，M1期15例；分化程度：低分化5例，中分化55例，高分化51例；切緣陽性16例、陰性63例；新輔助治療113例。注：內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心的15例份標(biāo)本缺失T分期、N分期、分化程度、切緣情況、新輔助治療等資料；霍普金斯醫(yī)療機(jī)構(gòu)的34例份標(biāo)本缺失切緣情況資料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用Allprep試劑盒(Qiagen)從快速冰凍腫瘤組織中提取癌細(xì)胞RNA，納升分光光度計(jì)定量Bioanalyzer2100評估RNA質(zhì)量。利用R2分析平臺(http://r2.amc.nl)進(jìn)行基因表達(dá)情況與生存數(shù)據(jù)的相關(guān)性運(yùn)算，通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析及Gene Ontology(GO)分析方法對CSF3R的相關(guān)基因通路進(jìn)行初步分析。生存數(shù)據(jù)的處理采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF3R表達(dá)與患者總體生存率的關(guān)系 CSF3R高表達(dá)患者62例，低表達(dá)患者40例；CSF3R表達(dá)水平與患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)(P=0.015)，高表達(dá)患者的總體生存率低于低表達(dá)患者(P<0.05)。見圖1。

圖1 CSF3R表達(dá)與患者總體生存率的關(guān)系

2.2 與CSF3R相關(guān)的基因 利用R2分析平臺，對數(shù)據(jù)集GSE21501中132個胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者的全部基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測出與CSF3R表達(dá)呈顯著相關(guān)的基因共6 521個，其中正相關(guān)基因3 040個、負(fù)相關(guān)基因3 481個，前20位正負(fù)相關(guān)基因見表1。

表1 與胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者CSF3R表達(dá)呈正負(fù)相關(guān)的前20位基因

2.3 基因通路 KEGG分析發(fā)現(xiàn)，與CSF3R相關(guān)的6 521個基因中，有1 943個基因涉及不同的信號通路。當(dāng)取P<0.001時(shí)，27個CSF3R高表達(dá)基因(C1QA、C1QB、C1QC、C2、C3AR1、C5、C5AR1、FCAR、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCGR3B、FGG、FPR1、FPR2、FPR3、HLA-DMB、HLA-DQA1、HLA-DQB1、ICAM1、ITGAM、ITGB2、MASP1、MASP2、MBL2、PLG、SELPLG)僅涉及1個信號通路，即金黃色葡萄球菌感染。GO分析發(fā)現(xiàn)，CSF3R及其相關(guān)基因主要與細(xì)胞對刺激的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、RAS調(diào)控、胰腺發(fā)育等相關(guān)。見表2。

表2 與胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者CSF3R相關(guān)基因的GO分析

3 討論

胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的惡性程度遠(yuǎn)高于其他實(shí)體腫瘤[5]。胰腺癌具有特殊的解剖結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，腫瘤組織長期處于缺血和低氧環(huán)境，腫瘤細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和異常的代謝模式[6]，但這些尚不能充分解釋胰腺癌的發(fā)病機(jī)理。隨著研究的不斷深入，胰腺癌組織全基因組測序技術(shù)的成熟和分子生物學(xué)的長足發(fā)展，為更深層次了解胰腺癌的生物學(xué)特征提供了條件，推動了胰腺癌早期診斷和特異性靶向治療的發(fā)展。

CSF3R是一種蛋白質(zhì)編碼基因，又名粒細(xì)胞集落刺激因子受體，位于1號染色體的p34區(qū)，由17 272個堿基構(gòu)成，有19個外顯子。該基因可以調(diào)控粒細(xì)胞的生成、分化和信號傳導(dǎo)[7]。CSF3R基因起初被認(rèn)為在粒細(xì)胞的生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用[8]。Maxson等[9]發(fā)現(xiàn)血液系統(tǒng)腫瘤中CSF3R突變，揭開了其在血液系統(tǒng)腫瘤研究的序幕。目前認(rèn)為，CSF3R突變與重度先天性中性粒細(xì)胞減少癥關(guān)系密切，可誘發(fā)其發(fā)展為急性髓細(xì)胞白血病(AML)[10]。CSF3R突變包括CSF3R T618I和CSF3R T615A兩種類型，常合并SETBP1基因突變[11]。

本研究對選取的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析證實(shí)，CSF3R對于胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌患者的總體生存期有明顯的預(yù)測作用，CSF3R高表達(dá)患者的總體生存期明顯短于低表達(dá)患者。盡管數(shù)據(jù)庫中有30例患者生存資料缺失，但仍提示CSF3R是一個明顯的促癌因素。本研究通過R2分析平臺檢測出與CSF3R表達(dá)顯著相關(guān)的基因共6 521個，經(jīng)計(jì)算與其高度正相關(guān)的部分基因均發(fā)揮不同程度的促癌作用。Hou等[12]報(bào)道，F(xiàn)PR2表達(dá)水平與胃癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)；Wang等[13]報(bào)道，CXCR2在胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲中起重要作用。對這6 521個基因的KEGG分析結(jié)果顯示，CSF3R高表達(dá)時(shí)僅涉及金黃葡萄球菌感染信號通路。Wang等[14]認(rèn)為，胰腺癌組織中炎性細(xì)胞浸潤程度越高，患者預(yù)后越差；Bayne等[15]報(bào)道，腫瘤來源的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是胰腺癌組織內(nèi)炎癥和免疫抑制的重要調(diào)節(jié)劑。葡萄球菌感染灶內(nèi)主要的炎性細(xì)胞為中性粒細(xì)胞。我們推測CSF3R高表達(dá)導(dǎo)致患者總體生存率降低可能與中性粒細(xì)胞的三種殺傷途徑有關(guān)，即吞噬、脫顆粒和中性粒細(xì)胞外網(wǎng)(NETs)。在吞噬過程中，為了消除和降解微生物，活性氧(ROS)、防御素和絲氨酸蛋白酶在吞噬體中釋放。ROS的持續(xù)釋放導(dǎo)致由中性粒細(xì)胞局部浸潤的組織微環(huán)境持續(xù)缺氧，而慢性持續(xù)性低氧環(huán)境在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Abdol Razak等[16]研究表明，胰腺癌細(xì)胞會刺激周圍中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，而NETs可促進(jìn)ROS對腫瘤組織及其間質(zhì)的殺傷作用，進(jìn)而誘導(dǎo)多種致癌因子的產(chǎn)生。Geller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌對吉西他濱產(chǎn)生耐藥是由于腫瘤組織中存在可以產(chǎn)生胞苷脫氨酶的特異性細(xì)菌；這些細(xì)菌可以代謝化療藥物，并募集中性粒細(xì)胞，使腫瘤產(chǎn)生耐藥性，這也從一個新的角度闡釋了細(xì)菌、炎癥和腫瘤相互促進(jìn)的關(guān)系。本研究 GO分析結(jié)果顯示，CSF3R與其相關(guān)基因在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了一系列功能，如免疫反應(yīng)、白細(xì)胞激活等。此外，其激活的ErbB信號通路也可以調(diào)控直腸癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[18]。在本研究數(shù)據(jù)集中CSF3R高表達(dá)導(dǎo)致胰腺癌患者不良預(yù)后，該結(jié)果為今后研究CSF3R在胰腺癌發(fā)展中作用的相關(guān)機(jī)制提供了思路。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展使臨床對胰腺癌有了新的認(rèn)識。轉(zhuǎn)錄組學(xué)與目前的細(xì)胞學(xué)研究不同，其雖可在短時(shí)間內(nèi)檢測到人類細(xì)胞或組織中所有基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但這種通過公共平臺的分析方法無法描述細(xì)胞間化學(xué)相互作用的真實(shí)情況。其次，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果只適用于群體患者，而不適用于單一患者，因此需要更大的樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過公共基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具有快捷、簡便、樣本量大的優(yōu)勢。本研究中CSF3R表達(dá)與胰腺癌患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)，可以為下一步CSF3R與胰腺癌相關(guān)分子機(jī)制的研究提供參考。