周曉，李憲孟，秦樹存

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東臨沂276000；2泰山醫(yī)學(xué)院)

1975年，Dole等[1]證實(shí)高壓氫氣能抑制小鼠皮膚原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)。隨后研究人員通過(guò)富氫培養(yǎng)液對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株干預(yù)的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，氫氣對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及接種形成的種植瘤有抑制作用[2～6]。本研究原代培養(yǎng)不同病例來(lái)源的人大腸腺癌細(xì)胞，探討氫氣對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)，優(yōu)級(jí)FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液、快速姬姆薩染液(Solarbio)。MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Annexin-V-FITC-PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、即用型SP免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所)。小鼠抗人CK-19抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。富氫培養(yǎng)液：采用AYH-300型高純氫氣發(fā)生器(純度>99.99%，北京天雨澤科技有限公司)，在0.4 MPa壓力下制備富含飽和氫氣的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存并于1周內(nèi)使用。使用前檢測(cè)氫氣濃度，以確保不低于0.6 mmol/L。

1.2 大腸腺癌細(xì)胞獲取、培養(yǎng)及分組處理 大腸腺癌細(xì)胞取自30例大腸腺癌患者?；颊呔?015年11月～2017年7月于山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院行大腸癌手術(shù)，病理明確診斷。其中男15例，女9例；年齡49～78(64.3±9.4)歲，≤60歲11例、>60歲13例；腫瘤位于結(jié)腸10例，位于直腸14例；Dukes A～B期8例，C～D期16例；Ki67陽(yáng)性率≤70% 10例，>70% 14例；血漿MDA≤3 μmol/L 14例，>3 μmol/L 10例；患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。術(shù)中無(wú)菌條件下取內(nèi)部無(wú)壞死的腫瘤組織，充分清洗后用胰蛋白酶反復(fù)消化。收集消化液，加入FBS終止消化，1 000 r/min離心5 min，DMEM/F12+2% FBS重懸細(xì)胞，以3×105個(gè)/mL細(xì)胞密度進(jìn)行原代培養(yǎng)。結(jié)合反復(fù)貼壁法和機(jī)械刮除法去除成纖維細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)CK19染色后，24例細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃至棕黃色陽(yáng)性顆粒，證明腫瘤均為上皮細(xì)胞來(lái)源，原代大腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)成功。當(dāng)細(xì)胞融合約80%左右時(shí)傳代，取2～3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組給予含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，氫氣組給予含10%血清飽和氫氣(≥0.6 mmol/L)的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法。將所有患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL共2×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)參照1.2方法進(jìn)行分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h終止培養(yǎng)。每孔加入10 μL MTT溶液于37 ℃避光孵育4 h，再加入100 μL Formanzan溶解液于37 ℃避光孵育4 h。將空白孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀562 nm處測(cè)定各孔光密度(OD)值。

1.4 細(xì)胞克隆情況檢測(cè) 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，在 6孔板中每孔種植2.0×102個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入普通培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，參照1.2方法進(jìn)行分組干預(yù)，每隔24 h更換新鮮制備的富氫培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。終止細(xì)胞培養(yǎng)，吸盡培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，洗去染色液，空氣干燥。倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)>10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)將1.2中兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 重懸細(xì)胞。取含有1×106個(gè)細(xì)胞的重懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻，再加入5 μL PI，混勻，室溫避光孵育10 min。1 h內(nèi)上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞活性、克隆數(shù)量及凋亡情況比較 對(duì)每例患者來(lái)源的細(xì)胞分別統(tǒng)計(jì)氫氣組和對(duì)照組的OD值，克隆數(shù)量及凋亡率，根據(jù)三項(xiàng)指標(biāo)的變化，分為氫氣干預(yù)有效和無(wú)效細(xì)胞，分別統(tǒng)計(jì)兩類細(xì)胞上述三項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，氫氣組15例患者的原代結(jié)腸癌細(xì)胞OD值、克隆數(shù)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)，提示氫氣干預(yù)有效。氫氣組9例患者的原代結(jié)腸癌細(xì)胞OD值、形成的克隆數(shù)量和細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，提示氫氣干預(yù)無(wú)效。兩組氫氣干預(yù)有效及無(wú)效細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)比較見表1、2。

表1 兩組氫氣干預(yù)有效細(xì)胞活性、克隆數(shù)及凋亡率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 兩組氫氣干預(yù)無(wú)效細(xì)胞活性、克隆數(shù)及凋亡率

2.2 氫氣對(duì)大腸癌細(xì)胞的干預(yù)效果與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 對(duì)15例氫氣干預(yù)有效的大腸癌原代細(xì)胞來(lái)源患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，血漿MDA>3 μmol/L和癌細(xì)胞Ki67表達(dá)陽(yáng)性率>70%患者的原代癌細(xì)胞被氫氣抑制的概率高于血漿MDA≤3 μmol/L和癌細(xì)胞Ki67表達(dá)陽(yáng)性率≤70%患者(P均<0.05)；患者性別、年齡、腫瘤位置及Dukes分期對(duì)原代癌細(xì)胞是否被氫氣抑制無(wú)顯著影響(P均>0.05)。見表3。

表3 氫氣對(duì)大腸癌細(xì)胞干預(yù)效果與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

目前已知的能夠被氫氣抑制的細(xì)胞株包括人舌鱗狀上皮細(xì)胞癌(HSC-4)、人肺腺癌(A549)、人纖維肉瘤(HT-1080)、Ehrlich腹水腫瘤(EAT)、人結(jié)直腸癌(SW480)、鼠大腸癌細(xì)胞(Colon26)等[1～6]，以大腸癌來(lái)源的細(xì)胞株較多，提示氫氣有可能成為大腸癌患者新的抗腫瘤化學(xué)藥物。

全身化學(xué)治療是不適合手術(shù)切除的大腸癌患者的主要治療方法。但化療藥物的毒副作用大，如奧沙利鉑(OX)導(dǎo)致的累積性末梢神經(jīng)障礙，術(shù)后輔助化療采用FLOX方案的患者多出現(xiàn)腹瀉等[9]。氫氣作為一種潛在的抗腫瘤藥物，迄今為止未發(fā)現(xiàn)其對(duì)人體有任何毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景；但是，目前關(guān)于氫氣抗腫瘤的研究?jī)H局限于對(duì)少數(shù)幾種細(xì)胞株的觀察，試驗(yàn)結(jié)果的適用性較差，還因?yàn)槿鄙倩颊叩男畔?，無(wú)法對(duì)臨床病理特征與氫氣抗腫瘤效果的相關(guān)性進(jìn)行分析，尚不能為氫氣的實(shí)際應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

本研究采集30例大腸腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，24例培養(yǎng)成功，成功率為80%。污染是原代培養(yǎng)失敗的主要原因，說(shuō)明利用原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行氫氣抗癌研究具有一定的局限性。本研究觀察了氫氣對(duì)24例原代癌細(xì)胞活性、增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)氫氣僅對(duì)15例患者來(lái)源的癌細(xì)胞具有抑制作用，有效率為62.5%。Asada等[6]報(bào)道氫氣對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG2)沒有抑制作用，提示氫氣的抗腫瘤作用受細(xì)胞株種類的限制。本研究提示，氫氣的抗腫瘤作用會(huì)受到細(xì)胞株來(lái)源的影響，因?yàn)椴煌竽c癌患者的原代癌細(xì)胞類似于不同來(lái)源的細(xì)胞株。本研究中氫氣有效原代癌細(xì)胞對(duì)照組的OD值、克隆數(shù)和凋亡率均數(shù)均高于氫氣無(wú)效對(duì)照組，也提示癌細(xì)胞本身的生物學(xué)特性是影響氫氣效果的重要因素。

目前認(rèn)為，清除活性氧(ROS)、抗氧化是氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用的主要機(jī)制[10]，包括抗腫瘤作用[2]。不同腫瘤細(xì)胞的基因突變對(duì)ROS的產(chǎn)生和清除途徑有不同的影響[11～14]，細(xì)胞內(nèi)ROS水平不一致可能是氫氣抗腫瘤作用出現(xiàn)差異的原因。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中生成的一種醛類物質(zhì)，是ROS氧化細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其血漿含量可間接反映組織及細(xì)胞受ROS損傷的程度[15]。血漿MDA含量高的患者可能處于氧化還原失衡的狀態(tài)，有助于氫氣發(fā)揮抗腫瘤作用。目前已證實(shí)氫氣能夠降低氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)MDA含量[16]。氧化/還原劑作為化療藥物治療腫瘤目前尚有爭(zhēng)議。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)受很多因素的影響，對(duì)腫瘤所起的作用也不確定。一些研究通過(guò)檢測(cè)患者的臨床指標(biāo)，如胰腺癌和肝癌患者的血漿硫氧還蛋白、腫瘤組織的抗氧化能力等預(yù)測(cè)氧化/還原劑的抗腫瘤療效[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿MDA能夠影響氫氣對(duì)原代癌細(xì)胞的抑制作用，提示將來(lái)可能通過(guò)檢測(cè)MDA預(yù)測(cè)氫氣的抗腫瘤效果，篩選適合氫氣治療的大腸癌患者。

持續(xù)的增殖活性是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特征，很多抗腫瘤藥物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮作用[19]。Ki67是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性、判斷腫瘤侵襲能力的重要參考指標(biāo)，在臨床中廣泛應(yīng)用[20]。有報(bào)道稱氫氣能夠降低腫瘤組織Ki67表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸腺癌組織Ki67表達(dá)普遍較高，以陽(yáng)性率為70%作為界限進(jìn)行分析，界限兩側(cè)癌細(xì)胞被氫氣抑制的概率也有顯著差別。這一結(jié)果也與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中氫氣有效15例原代癌細(xì)胞對(duì)照組的克隆數(shù)和OD值均數(shù)均高于氫氣無(wú)效9例對(duì)照組相吻合。究其原因，可能與增殖旺盛的惡性腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)較強(qiáng)，ROS在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中具有中介作用[21]，有利于氫氣發(fā)揮作用有關(guān)。

本研究尚存在一些缺陷。首先，樣本量小，得出的結(jié)論尚需更大樣本量的研究證實(shí)；其次，選取樣本的隨機(jī)性較強(qiáng)，一些指標(biāo)如腫瘤的組織學(xué)類型因?yàn)楦鳂颖敬笾孪嗤y以進(jìn)行分析；再次，本研究患者均為初次診斷和治療，所得出的結(jié)論不一定適用于復(fù)發(fā)或者已經(jīng)進(jìn)行過(guò)治療的大腸癌患者；最后，僅分析了氫氣對(duì)大腸癌原代細(xì)胞的作用以及影響這種作用的臨床因素，沒有進(jìn)行機(jī)制方面的進(jìn)一步研究。

綜上所述，氫氣對(duì)原代人大腸腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，血漿MDA含量和腫瘤組織Ki67表達(dá)可能影響氫氣的臨床抗腫瘤效果。