，，

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院(深圳福田)婦產(chǎn)科,廣東 深圳 518033)

卵巢癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌和宮頸癌，死亡率占所有婦科惡性腫瘤死亡率之首，是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一[1]。卵巢位于盆腔內(nèi)，位置深、發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，70%以上的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展為晚期[2]。手術(shù)根治和化療是治療卵巢癌的首選方法，但臨床效果不盡人意，晚期患者5年生存率低至25%～30%[3]。所以探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于其臨床防治具有重要意義。中心體相關(guān)蛋白55(centrosomal protein of 55，CEP55)是卷曲螺旋蛋白家族成員之一，錨定微管聚合相關(guān)蛋白，參與紡錘體的形成，從而調(diào)控細(xì)胞周期[4-5]。研究顯示，CEP55與胃癌[6]、乳腺癌[7]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而有關(guān)CEP55與卵巢癌生物學(xué)行為的關(guān)系，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過慢病毒介導(dǎo)siRNA干擾CEP55表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響，從而為卵巢癌的臨床防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料卵巢癌SKOV3細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；SPF級(jí)雄性BABL/c小鼠，6～8周齡(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK滬2012-0005)；RM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司,美國)；CEP55 siRNA慢病毒載體(System Biosciences公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(ABI Applied Biosystems公司，美國)；TRIzol法RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)；兔抗人CEP55一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、BAD顯色試劑盒(Santa Cruz公司，美國)；噻唑藍(lán)(Sigma公司，美國)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(羅氏公司，瑞士)；超凈工作臺(tái)、恒溫CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司，美國)；低溫高速離心機(jī)、微量移液槍(Eppendorff公司，美國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法SKOV3細(xì)胞株接種于RM-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)；置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞融合至85%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代。

1.3CEP55 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選取對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞長滿至60%時(shí)，隨機(jī)分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：(1)CEP55組：用CEP55 siRNA慢病毒(MOI=50)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，(2)陰性對(duì)照組：用不含CEP55 siRNA基因的慢病毒(MOI=50)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，(3)空白對(duì)照組：不處理，未用慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率=(熒光表達(dá)細(xì)胞數(shù)目/白光視野細(xì)胞總數(shù))×100%。

取上述各組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分批次加入0、1、2、3、4、5μg/mL的嘌呤霉素，14天內(nèi)讓所有細(xì)胞死亡的最低濃度嘌呤霉素即為最佳篩選濃度。再取上述各組細(xì)胞接種于6孔板，孵育24 h后加入最佳篩選濃度的嘌呤霉素，隔天更換新的培養(yǎng)液(含最佳篩選濃度的嘌呤霉素)，連續(xù)培養(yǎng)10天，收集抗性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定抑制CEP55表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.4RT-CR和Western blot檢測(cè)CEP55表達(dá)(1)收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，A260/A280比值1.8～2.0提示樣品RNA滿足實(shí)驗(yàn)要求，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，引物委托上海吉瑪公司合成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Bio-Rad掃描分析，目的基因表達(dá)量=目的基因光密度值/內(nèi)參基因光密度值。(2)收集各組細(xì)胞總蛋白，80 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。TBS-T漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人CEP55一抗工作液(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBS-T漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。TBS-T漂洗，暗室內(nèi)BAD顯色、曝光，Bio-Rad掃描分析。目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.5噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組同1.3，細(xì)胞接種于96孔板，分別于12、24、36、48、72 h每孔加入20 μL噻唑藍(lán)溶液(5 mg/μL)。4 h后甩干，每孔再加入二甲基亞砜150 μL，待結(jié)晶溶解后，酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定OD值，并繪制生長曲線。

1.6TUNEL法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組同1.3，細(xì)胞接種于放置蓋玻片的6孔板，48 h后收集蓋玻片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗1次，磷酸鹽緩沖液漂洗2次。加入Proteinase K工作液，37 ℃下孵育30 min。磷酸鹽緩沖液漂洗2次，加入50 μL的TUNEL反應(yīng)混合液，封膜，暗濕盒中37 ℃下孵育30 min。磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加50 μL的converter-POD工作液，封膜，暗濕盒中37 ℃下孵育30 min。磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加入100 μL的DAB顯色劑，25 ℃下孵育10 min。磷酸鹽緩沖液漂洗3次，蘇木素，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分組同1.3，用不含血清的RM-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于Transwell小室上室，同時(shí)在Transwell小室下室中加入含10%胎牛血清的RM-1640培養(yǎng)液。孵育48 h后，用棉簽擦去基底膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞，基底膜外側(cè)的細(xì)胞用4%中性甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)目。

1.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分組同1.3，將細(xì)胞接種于6孔板，待融合至85%時(shí)，在6孔板底部劃直線，用不含血清的RM-1640培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，48 h后棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞經(jīng)4%中性甲醛固定，Gimesa染色，細(xì)胞遷移能力=0 h劃痕距離-48 h劃痕距離。

2　結(jié)　　果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選轉(zhuǎn)染48 h后，CEP55組和陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率分別為(89.4±4.7)%和(87.5±4.3)%，并經(jīng)最佳濃度的嘌呤霉素(4 μg/mL)篩選得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。見圖1。

圖1　熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況(100×)空白對(duì)照組未見綠色熒光蛋白，CEP55組和陰性對(duì)照組可見大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功

2.2各組細(xì)胞CEP55表達(dá)比較RT-CR和Western blot檢測(cè)顯示，CEP55組CEP55 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表1和圖2。

表1　RT-CR和Western blot檢測(cè)CEP55表達(dá)

圖2　Western blot檢測(cè)CEP55蛋白表達(dá)

2.3干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的影響細(xì)胞生長曲線顯示，第12、24、36、48、72 h時(shí)，CEP55組OD(570)值明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)；TUNEL檢測(cè)顯示，CEP55組細(xì)胞凋亡率(23.7±6.9)%顯著大于陰性對(duì)照組(5.3±1.4)%和空白對(duì)照組(6.4±1.1)%，(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3　噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4　TUNEL檢測(cè)干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響(200×)A1～C1顯示用DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色，A2～C2顯示用TUNEL染色的凋亡細(xì)胞

2.4干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，CEP55組穿膜細(xì)胞數(shù)目(11.3±4.1)個(gè)，明顯少于陰性對(duì)照組(33.8±7.3)和空白對(duì)照組(37.5±7.0)，(P<0.05)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，CEP55組細(xì)胞遷移距離(245.8±33.7)μm，明顯小于陰性對(duì)照組(447.8±53.1)μm和空白對(duì)照組(453.6±55.2)μm，(P<0.05)。見圖5、圖6。

圖5　Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響(100×)

圖6　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾CEP55表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響(100×)

3　討　　論

中心體是一個(gè)非膜性細(xì)胞器，位于細(xì)胞核周圍，作為細(xì)胞中首要的微管組織，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，中心體由中心粒和中心粒周圍物質(zhì)兩部分組成[8]。CEP55是中心粒周圍物質(zhì)中的重要調(diào)節(jié)蛋白，參與微管聚集、紡錘體裝配、極化、分離和胞質(zhì)分裂，F(xiàn)abbro等[9]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)沉默CEP55可導(dǎo)致多核細(xì)胞、中期紡錘體異常，細(xì)胞停滯于中間體階段，胞質(zhì)分裂失敗。此外，CEP55還參與中心體功能的調(diào)節(jié)，其表達(dá)異常導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞和不穩(wěn)定染色體組的出現(xiàn)，而多種惡性腫瘤細(xì)胞中均存在非整倍體細(xì)胞和不穩(wěn)定染色體組[10]。說明CEP55參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。張勇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CEP55表達(dá)能夠顯著抑制肝癌HepG2和HeP3B細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞G2周期。于震男等[12]研究顯示，CEP55在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著增加，而沉默CEP55表達(dá)可顯著抑制膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。然而有關(guān)CEP55與卵巢癌生物學(xué)行為的關(guān)系，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

RNA干擾技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的技術(shù)，已成為實(shí)現(xiàn)基因功能研究和基因治療的重要手段[13-14]。制約RNA干擾技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵在于如何將外源性siRNA完整送入靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)靶基因沉默。質(zhì)粒和病毒是目前常用的兩組siRNA載體，其中質(zhì)粒載體制備簡(jiǎn)單，然而導(dǎo)入效率不高，且很難實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá)。病毒載體主要包括慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中慢病毒具有導(dǎo)入效率高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)⑼庠葱詓iRNA高效整合至靶細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定表達(dá)[15-16]。

本文采用了siRNA慢病毒載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEP55 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染效率為(89.4±4.7)%，CEP55組CEP55的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，說明CEP55 siRNA轉(zhuǎn)染成功并有效抑制CEP55表達(dá)，此外通過嘌呤霉素篩選，獲得了穩(wěn)定抑制CEP55表達(dá)的細(xì)胞株。惡性腫瘤的特點(diǎn)之一就是細(xì)胞接觸生長抑制性喪失，為了驗(yàn)證CEP55與腫瘤細(xì)胞異常增殖的關(guān)系，本研究觀察了干擾CEP55表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEP55組第12、24、36、48、72 h時(shí)的OD(570)值顯著降低，細(xì)胞凋亡率[(23.7±6.9)%]顯著增加，說明干擾CEP55表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CEP55與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究進(jìn)一步觀察了干擾CEP55表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEP55組穿膜細(xì)胞數(shù)目[(11.3±4.1)/個(gè)]明顯減少，細(xì)胞遷移距離[(245.8±33.7) μm]明顯減小，說明干擾CEP55表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)siRNA干擾CEP55表達(dá)可顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡、降低其侵襲和遷移能力。從而為卵巢癌的臨床治療提供了新的思路和靶點(diǎn)，但CEP55與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。