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(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

骨髓干細(xì)胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)移植技術(shù)治療肝臟疾病是研究的熱點(diǎn)。BMSCs是一類具有多向分化能力的干細(xì)胞，在BMSCs分化過程中受到微環(huán)境及細(xì)胞因子的影響，其中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)作為一種多功能因子，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)分化及器官的發(fā)育等過程。近期研究表明HGF對(duì)BMSCs具有誘導(dǎo)肝向分化作用，本文就HGF對(duì)BMSCs肝向誘導(dǎo)分化過程中相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行綜述。

1　骨髓干細(xì)胞

細(xì)胞分化是同一來源的細(xì)胞涉及多種細(xì)胞因子及信號(hào)通道相互影響而逐漸形成各自特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征的復(fù)雜過程。BMSCs是多向潛能的干細(xì)胞，在特定的細(xì)胞微環(huán)境中，BMSCs可定向分化。HGF在BMSCs肝向分化過程中占有重要地位，可在一定的條件下，HGF誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞分化[1]。因此，HGF作為體外誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞方向分化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，是肝臟生長(zhǎng)發(fā)育過程中最基本的細(xì)胞因子。

2　HGF及受體c-Met的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

HGF作為一種多功能因子，參與細(xì)胞的增殖，分化，遷移等生物功能。HGF在人體多種細(xì)胞中表達(dá)，HGF是BMSCs以內(nèi)分泌或旁分泌的形式分泌，由α鏈和β鏈組成，通過生物活性二硫鍵連接的異源二聚體[2]。目前的研究，主要集中在HGF誘導(dǎo)BMSCs肝向分化上。HGF通過與其受體c-Met結(jié)合而起作用。當(dāng)HGF與其受體相結(jié)合，招募銜接蛋白生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2，Grb2)和Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1(grb-2-associated binder 1，Gab1)磷酸化。Grb2和Gab1是與受體直接相互作用的關(guān)鍵效應(yīng)物，和其他銜接蛋白一起為更大的網(wǎng)絡(luò)蛋白裝置提供支架，最終促進(jìn)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活[3]。

HGF特異性受體c-Met蛋白由c-Met原癌基因編碼，是含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白質(zhì)。配體與受體結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化，被胞內(nèi)含有src家族同源2結(jié)構(gòu)域(src homology domain2，SH2)的信號(hào)分子識(shí)別并結(jié)合，從而激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3　參與HGF誘導(dǎo)BMSCs肝向分化的信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，c-Met激活后主要通過有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路將信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[4](圖1)。

3.1有絲分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路MAPK信號(hào)可被生長(zhǎng)因子激活，通過它們的同源酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，TRK)發(fā)出信號(hào)。MAPK通路的信號(hào)通過由MAPK激酶(MAP kinase kinasekinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK構(gòu)成的三級(jí)激酶的依次激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等多種重要的細(xì)胞生理過程。

圖1　HGF/c-Met信號(hào)通路調(diào)節(jié)BMSCs分化的途徑注：當(dāng)HGF與BMSCs上的c-Met受體結(jié)合，促進(jìn)自磷酸化，激活不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。Grb2：生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2;Gab1：Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1；sos：鳥苷核苷酸交換因子；Ras：Ras激酶；Raf：Raf激酶；ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；PI3k：磷脂酰肌醇3-激酶；PKB：蛋白激酶B(又稱AKT或Rac)； MEK，絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶。PLCγ：磷脂酶 Cγ1；Pkc：蛋白激酶C

MAPK的活性受Ras激酶(rat sarcoma，Ras)/ Raf激酶(rapidly Accelerated Fibrosarcoma，Raf)表達(dá)調(diào)控，主要由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERKs)，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNKs)和p38MAPKs三部分組成。一般而言，ERK信號(hào)通常與有絲分裂刺激激活的細(xì)胞存活，增殖和分化有關(guān)，而JNK和p38路徑通常參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡[3]。BMSCs分化可通過激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。T.Lu等[5]證實(shí)HGF和其他生長(zhǎng)因子通過MAPK通路促進(jìn)了BMSCs向肝細(xì)胞的分化，當(dāng)ERK/MAPK信號(hào)通路受到抑制，肝向分化細(xì)胞比例顯著降低，進(jìn)一步證明了ERK/MAPK信號(hào)通路參與了BMSCs的肝向分化。

c-Met受體具有酪氨酸激酶活性，與生長(zhǎng)因子結(jié)合導(dǎo)致自磷酸化，為含有SH2或磷酸酪氨酸結(jié)合(phosphotyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域的蛋白如Grb2提供對(duì)接位點(diǎn)。這些銜接蛋白招募更多的效應(yīng)物，如鳥苷酸交換因子(son of sevenless，SOS)。Gab1可以與c-Met結(jié)合被酪氨酸磷酸化，也可間接被Grb2激活。當(dāng)Gab1被受體c-Met直接激活時(shí)，Gab1酪氨酸磷酸化持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，伴有MAPK及蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)的活化，從而引起細(xì)胞的變形分化。GRB2與SOS結(jié)合，然后被募集到質(zhì)膜。SOS蛋白是一種鳥苷核苷酸交換因子(guanine Nucleotide Exchange Factor，GEF)，可促進(jìn)Ras蛋白釋放GDP，結(jié)合GTP，導(dǎo)致活性GTP結(jié)合形式的Ras增加。

Ras是一種單一的GTP酶分子。Ras蛋白在活性GTP結(jié)合形式和非活性GDP結(jié)合形式之間循環(huán)。在正常的靜息細(xì)胞中，Ras與GDP結(jié)合并處于非活動(dòng)的狀態(tài)，而在細(xì)胞外刺激下，Ras結(jié)合GTP，其具有比GDP更多的磷酸基團(tuán)，Ras被激活。因此，Ras蛋白在控制細(xì)胞增殖、分化等生理活動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起開關(guān)作用。

Raf介導(dǎo)的MAPK途徑是Ras幾個(gè)重要的下游級(jí)聯(lián)之一。激活的Ras導(dǎo)致Raf途徑的第一個(gè)MKKK的活化。Raf磷酸化并激活MAPK激酶(包括MEK1、MEK2)，后者繼續(xù)磷酸化并激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(包括ERK1、ERK2)。ERK1/2是最終的效應(yīng)物，并對(duì)大量的下游分子(核和胞質(zhì))發(fā)揮作用。ERK1/2底物包括核成分，轉(zhuǎn)錄因子，膜蛋白和蛋白激酶，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物功能[6]。

信號(hào)通路也受到負(fù)反饋回路的很大影響。ERK磷酸化并抑制SOS，Raf和MEK1，減少ERK激活。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)方式反應(yīng)了MAPK信號(hào)通路在BMSCs分化中的精確平衡。

有研究表明，通過MAPK信號(hào)通路還可以進(jìn)一步影響其他信號(hào)通路，如MAPKs在NF-κB信號(hào)通路的活化中發(fā)揮重要的作用，可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡[7]。當(dāng)阻滯ERK通路時(shí)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子β-鏈蛋白(β-catenin)核定位的減少，從而抑制了Wnt信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)[8]。

3.2磷脂酰肌醇激酶通路PI3K信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、衰老、生存等細(xì)胞功能。P13K屬脂類激酶家族，其中I類P13K是研究最多的，是由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85)組成的異源二聚體,可被酪氨酸激酶活性受體和G蛋白偶聯(lián)受體、Ras基因激活[9]。PI3K招募到細(xì)胞膜上，在體外可將PI4-磷酸酯轉(zhuǎn)化成PI3,4二磷酸酯，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)[10]。PIP3與PKB和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將兩個(gè)分子都募集到緊鄰的質(zhì)膜上，其中PKB通過PDK1在Tyr-308處的磷酸化被激活[11]。

結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex，TSC)作為Ras同源腦富集蛋白(rashomologenriched in brain，RHEB)的GTP酶活化蛋白，在穩(wěn)定狀態(tài)下可引起RHEB對(duì)GTP進(jìn)行水解，從而將該蛋白從其活性GTP結(jié)合形式轉(zhuǎn)化為其無活性GDP結(jié)合態(tài)。TSC被活化的PKB磷酸化，抑制RHEB活性，從而激活雷帕霉素(the mammalian target of rapamycin，mTOR)。在PI3K途徑活化后，上游激酶PKB也可直接磷酸化TSC2，并使得能夠通過RHEB活化mTOR，從而允許信號(hào)傳播[12]。

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過兩種不同的多蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2發(fā)揮細(xì)胞生物調(diào)節(jié)重要作用。mTORC1是主要的下游效應(yīng)物，控制下游靶標(biāo)蛋白質(zhì)合成。激活的mTORC1通過磷酸化兩種主要的下游分子：翻譯調(diào)控因子真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1，4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶(ribosomal S6 kinase，S6K)，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的生物功能[13]。激活的S6K使mTORC2失活，通過負(fù)反饋回路抑制PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而mTORC2通過PKB促進(jìn)細(xì)胞存活，它可直接磷酸化Ser473上的PKB，對(duì)PKB的活化起到積極的作用。另一方面，mTORC2可以進(jìn)一步調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞極性的組織，從而決定細(xì)胞的形態(tài)。

PI3K-PKB通路還可以影響其它信號(hào)通路的傳遞，如通過其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族(E-twenty six，ETS)和核因子κB(nuclear Factor-KappaB，NF-κB)參與基因表達(dá)和細(xì)胞周期的調(diào)控。激活的PKB啟動(dòng)下游信號(hào)事件的級(jí)聯(lián)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，代謝，增殖，存活等生物功能，并間接觸發(fā)級(jí)聯(lián)事件，進(jìn)而激活下游多種效應(yīng)蛋白及通路，這些信號(hào)蛋白包括絲氨酸-蘇氨酸激酶(PKB和PDK1)、蛋白酪氨酸激酶( Tec/BTK家族)、GTP結(jié)合蛋白的交換因子(grp1和Rac交換因子)、細(xì)胞骨架蛋白和Gab1，影響包括p38 MAPK、NF-κB和JNK/SAPK途徑[11]。

PI3K信號(hào)通路被人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)和Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶(inositol polyphosphate 4-phosphatase type II，INPP4B)精確調(diào)控。PTEN是一種抑癌基因，具有蛋白磷酸酶活性劑脂質(zhì)磷酸酶活性，對(duì)細(xì)胞周期、多種信號(hào)途徑起負(fù)性調(diào)控作用。PTEN將PIP3去磷酸化PIP2，下調(diào)PI3K/PKB信號(hào)通路，使細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等活動(dòng)受到抑制。INPP4B是一種脂質(zhì)磷酸酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇的穩(wěn)定，將磷脂酰肌醇3,4-二磷酸去磷酸化為3-磷酸磷脂酰肌醇，使PKB的激活受到抑制，導(dǎo)致PI3K/PKB信號(hào)通路被阻斷[14]。提示PTEN通過調(diào)控PI3K信號(hào)通路抑制細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。

P13K是存在于細(xì)胞質(zhì)中的脂類激酶，被HGF激活后，可活化下游關(guān)鍵蛋白PKB，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物功能。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs分化過程中有下游蛋白PKB的表達(dá)，通過應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002阻斷該通路在BMSCs中的活化，觀察到BMSCs在增殖分化過程中受到了抑制，這主要表現(xiàn)在PKB的表達(dá)減少[15]。BMSCs的增殖分化能力明顯下調(diào)，證明了阻斷PI3K通路將抑制細(xì)胞的活性。

3.3蛋白激酶C通路HGF/c-Met還可以激活磷脂酶 Cγ1/二脂酰甘油/蛋白激酶C 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PLCγ1 /DAG/PKC 信號(hào)通路)，廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分裂等生理活動(dòng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，PKC的持續(xù)激活是一些細(xì)胞分化所必須的。PKC信號(hào)通路中的下游信號(hào)分子如cdc2，cyclinB磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。PKC通過Raf-1激活MAPK通路，把信號(hào)傳入核內(nèi)。另外，PKC的直接磷酸化底物還包括核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,I-κB)和豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物蛋白(myristoylated alanine-rich C-kinase substrate，MARCKs)。其中I-κB在PKC的磷酸化下解離出有活性的NF-κB，它作為轉(zhuǎn)錄因子，也調(diào)節(jié)著許多早期反應(yīng)基因c-fos，c-jun等的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化等[16]。綜上表明PKC 信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。

4　誘導(dǎo)分化時(shí)細(xì)胞的變化

BMSCs肝向分化是一個(gè)綜合變化的復(fù)雜過程，隨著細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，細(xì)胞在分化過程中逐漸出現(xiàn)相關(guān)基因的改變及表達(dá)的改變，對(duì)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)等有著密切的影響，并出現(xiàn)肝細(xì)胞特有的代謝產(chǎn)物。

4.1基因表達(dá)的改變研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs肝向分化過程中有121個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了變化，其中約73%基因上調(diào)，約27%基因下調(diào)。這些基因涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等[17]。研究進(jìn)一步指出，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(serum and Glucocorticoid Induced Kinase，SGK)基因可以通過HGF被激活，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，以及細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的信號(hào)通路。通過HGF聯(lián)合其他因子誘導(dǎo)BMSCs研究發(fā)現(xiàn)，HGF可促進(jìn)血清和SGK的上調(diào)，有利于細(xì)胞的存活及增殖，為BMSCs肝向分化提供了基礎(chǔ)。姜華等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨髓MSCs肝向分化模型中，利用芯片檢測(cè)出，F(xiàn)as、G6pc、S100a1、Ndufa7基因表達(dá)增加。Fas為內(nèi)源性脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，參與脂肪代謝。G6pc 為葡萄糖-6-磷酸酶，是糖代謝過程中的關(guān)鍵酶。S100a1 參與大量細(xì)胞的周期調(diào)控、分化等過程。Ndufa7是泛醌氧化還原酶，存在于細(xì)胞線粒體上，參與線粒體呼吸鏈的調(diào)節(jié)，生成ATP。

4.2特殊蛋白的表達(dá)及代謝的改變甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白、細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)、α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)，酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrosine aminotransferase，TAT)是肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物。AFP及白蛋白是肝前體細(xì)胞分泌的一種胞漿蛋白，在幼稚的肝前體細(xì)胞中表達(dá)，是肝細(xì)胞未成熟的標(biāo)志，隨著細(xì)胞的成熟而消失。CK18是骨架蛋白，和白蛋白一起表達(dá)在成熟肝細(xì)胞中。有研究發(fā)現(xiàn)，利用HGF等誘導(dǎo)BMSCs肝向分化后，可以檢測(cè)到白蛋白和CK-18蛋白的表達(dá)，提示BMSCs逐漸分化為成熟肝細(xì)胞[18]。

只有肝細(xì)胞才能產(chǎn)生、儲(chǔ)存糖原，因此，在骨髓肝細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，可檢測(cè)出糖原的存在。Li等[19]對(duì)BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入HGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后，觀察到BMSCs糖原的產(chǎn)生，并進(jìn)一步檢測(cè)到BMSCs產(chǎn)生的AFP、CK18、ALB的表達(dá)，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在HGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下，可向肝樣細(xì)胞分化。Al Ghrbawy NM等[20]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs經(jīng)肝細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理后，出現(xiàn)上皮細(xì)胞多邊形的變化，并表達(dá)肝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)，證明了BMSCs成功分化為肝樣細(xì)胞。

HGF/c-Met信號(hào)通路具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡等功能，在BMSCs分化中發(fā)揮重要的作用，其中有PI-3K、MAPK、PKC等信號(hào)通路的參與。通過調(diào)控基因表達(dá)，BMSCs分化為肝細(xì)胞，表達(dá)AFP、白蛋白、CK18等肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，并產(chǎn)生糖原及尿素。目前人們對(duì)HGF涉及的通路認(rèn)識(shí)還不完善，比如HGF與受體c-Met結(jié)合后其大量的生物學(xué)結(jié)點(diǎn)研究較少，各通路相互之間的聯(lián)系，及其它信號(hào)通路的激活狀態(tài)等仍有未知。HGF誘導(dǎo)的BMSCs肝向分化，有利于肝臟的組織修復(fù)，隨著BMSCs肝向分化研究的不斷完善，將為肝病的治療提供理論依據(jù)和參考。