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(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

黃酮是一類(lèi)天然產(chǎn)物，廣泛存在于自然界中，表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性。在過(guò)去數(shù)十年中，大量天然、半合成和全合成的黃酮類(lèi)化合物已被開(kāi)發(fā)用于各種疾病的治療，如抗腫瘤[1]，抗炎[2]，抗菌[3]，抗氧化[4]等。

苯三甲氧基在抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)中具有較高的研究?jī)r(jià)值，特別是在血管阻斷劑的設(shè)計(jì)中。目前處于臨床研究的血管阻斷劑候選藥物中，CA4P[5]及其類(lèi)似物OXi4503[6]和AVE8062[7]，以及秋水仙堿類(lèi)似物ZD6126[8],BNC105[9]和CKD-516[10](圖1)結(jié)構(gòu)中均含苯三甲氧基基團(tuán)。

此外，苯并咪唑類(lèi)化合物也已被廣泛用于抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。苯并咪唑及其衍生物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和增殖，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)[11]。因此，在本文中，苯三甲氧基在黃酮B環(huán)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，再與苯并咪唑類(lèi)化合物衍生化得到9個(gè)全新的3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮苯并咪唑衍生物，并初步評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性。

圖1　CA4P，OXi4503，AVE8062，ZD6126，BNC-105和CKD-516的結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1.1主要試劑間苯二酚(98%)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛(98%)、氯乙腈(98%)、1，2-二溴乙烷(98%)、1，3-二溴丙烷(98%)、1,4-二溴丁烷(98%)、2-甲基苯并咪唑(98%)、2-氯苯并咪唑、(98%)、2-三氟甲基苯并咪唑(98%)購(gòu)于阿拉丁試劑；胎牛血清FBS、RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司)；柱層析硅膠板(安徽躍化硅材料有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.2主要儀器Thermo Scientific Electrothermal Digital熔點(diǎn)測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)，Bruker AV-400型光譜儀(美國(guó)Bruker公司)，Waters GCT質(zhì)譜儀(英國(guó)Waters公司)，WellscanMK-2酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)。

1.3方法

1.3.1化學(xué)合成目標(biāo)化合物4-12采用的合成路線(xiàn)如圖2所示。3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮(2)的合成：將間苯二酚(2.5 g,0.023 mol)置于100 mL的三頸瓶中，加入無(wú)水乙醚30 mL，冰浴冷卻，原料溶解完全后加入氯乙腈(2 mL,0.032 mol)與催化量的無(wú)水氯化鋅，充分混勻，通入干燥氯化氫，3 h后將反應(yīng)瓶4 ℃放置1 天，再通氯化氫2 h，4 ℃放置1 天，過(guò)濾，無(wú)水乙醚洗滌橘黃色沉淀，適量熱水將洗滌后的橘黃色沉淀溶解于圓底燒瓶中，水浴加熱回流1 h，4 ℃靜置過(guò)夜，抽濾，即得到化合物2′-羥基-2-氯苯乙酮(1)。將化合物1 (2.2 g,0.012 mol)與3,4,5-三甲氧基苯甲醛(2.0 g,0.01 mol)混合，加入20 mL 95%乙醇溶解，搖勻，慢慢加入10 mL 10% NaOH，室溫下攪拌2 天，用10% HCl調(diào)節(jié)pH至有黃色沉淀析出，抽濾，沉淀用無(wú)水乙醇溶解，緩慢滴加蒸餾水直至有結(jié)晶出現(xiàn)，靜置過(guò)濾即得到化合物3′4′5-三甲氧基-7-羥基黃酮(2)。7-(2-溴乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3a)的合成：在250 mL圓底燒瓶依次加入化合物2(0.1 mol)、1，2- 二溴乙烷(0.4 mol)和少量的無(wú)水碳酸鉀，丙酮溶液中(100mL)回流9 h(反應(yīng)用薄層色譜法監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，通過(guò)硅膠柱分離純化，洗脫劑為二氯甲烷-甲醇(100∶1)?；衔?-(3-溴丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3b)和7-(4-溴丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3c)的合成：與化合物2a合成方法類(lèi)似。7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：在100 mL圓底燒瓶依次加入化合物2a(0.01 mol)、2-甲基苯并咪唑(0.02 mol)和碳酸鉀(0.02 mol)，溶解于30 mL丙酮，加熱回流約12 h。反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，通過(guò)硅膠柱分離純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇(150∶1)。化合物5-12的合成：與化合物4合成方法類(lèi)似。

圖2　黃酮苯并咪唑衍生物4-12的合成路線(xiàn)

1.3.2體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)采用MTT法研究化合物4-12對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2的體外抗增殖活性，以5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照。胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞均在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為8×103/孔，24 h后用不同濃度(256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L)的化合物進(jìn)行了處理。48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。4 h后，每個(gè)孔加入150 μL的DMSO溶解晶體，并在490 nm處測(cè)量吸光度。50%細(xì)胞的抑制濃度(IC50)是由Logit法測(cè)定的。所有實(shí)驗(yàn)均操作三次。

2　結(jié)　　果

2.1目標(biāo)化合物的表征7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：橘黃色粉末,產(chǎn)率: 53%，Mp:192-193℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71-7.67(m,1H),7.66(s,1H),7.37-7.32(m,1H),7.27-7.25(m,2H),7.10(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.0 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.60(d,J=2.0 Hz,1H),4.59(t,J=5.3 Hz,2H),4.39(t,J=5.2 Hz,2H),3.92(t,J=8.8 Hz,9H),2.72(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.90(s),165.30(s),153.28(s),152.04(s),147.09(s),142.65(s),139.89(s),134.82(s),127.63(s),126.01(s),122.38(s),122.30(s),119.36(s),115.55(s),112.63(s),111.98(s),108.83(s),108.75(s),97.29(s),66.71(s),61.02(s),56.22(s),42.97(s),14.11(s). MS(ESI):486.1(C28H26N2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(5)：黃色粉末,產(chǎn)率: 78%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.70(d,J=7.1 Hz,1H),7.66(d,J=8.5 Hz,1H),7.44(d,J=7.4 Hz,1H),7.37-7.26(m,2H),7.11(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.1 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.63(d,J=2.0 Hz,1H),4.66(t,J=5.4 Hz,2H),4.41(dd,J=10.6,5.1 Hz,2H),3.92(t,J=8.7 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.92(s),165.23(s),153.31(s),147.11(s),141.74(s),140.49(s),140.14-139.67(m),135.28(s),127.65(s),126.03(s),123.52(s),123.09(s),119.73(s),115.62(s),112.60(s),112.06(s),109.55(s),108.77(s),97.34(s),66.46(s),61.03(s),56.24(s),43.51(s). MS(ESI):507.1(C27H23ClN2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(6)：黃色粉末，產(chǎn)率: 77%,Mp:207-208℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=8.0 Hz,1H),7.67(t,J=8.3 Hz,2H),7.51(t,J=7.5 Hz,1H),7.42(t,J=7.6 Hz,1H),7.12(s,2H),6.74(s,1H),6.71-6.58(m,2H),4.82(s,2H),4.47(s,2H),3.94(t,J=8.2 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.70(s),167.93(s),165.11(s),153.32(s),147.08(s),141.08(s),139.97(s),135.82(s),127.62(s),126.04(s),125.71(s),124.07(s),121.84(s),115.66(s),112.69(s),112.11(s),110.89(s),108.81(s),97.20(s),66.95(s),61.03(s),56.25(s),44.08(s). MS(ESI):540.1(C28H23F3N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4--酮(7)：黃色粉末,產(chǎn)率: 57%，Mp:169-171℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.62(t,J=8.8 Hz,2H),7.19(t,J=12.3 Hz,2H),7.11(td,J=14.2,6.7 Hz,3H),6.67(d,J=11.4 Hz,2H),6.56(s,1H),4.30(t,J=6.3 Hz,2H),3.90(dd,J=12.8,7.5 Hz,2H),3.83(d,J=3.5 Hz,9H),2.44(d,J=42.5 Hz,2H),2.28(dd,J=11.8,5.7 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.74(s),168.14(s),165.86(s),153.29(s),151.52(s),147.19(s),142.44(s),139.89(s),134.88(s),127.69(s),126.02(s),122.32(s),122.15(s),119.12(s),115.32(s),112.50(s),112.32(s),109.01(s),108.76(s),97.19(s),64.76(s),61.00(s),56.21(s),40.07(s),28.84(s). MS(ESI):500.1(C29H28N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(8)：黃色粉末,產(chǎn)率: 66%，Mp:140-142℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.72(t,J=7.8 Hz,1H),7.56(s,1H),7.37-7.29(m,2H),7.14(s,2H),7.07(s,1H),6.76(d,J=6.8 Hz,1H),6.65(s,1H),4.49(t,J=5.7 Hz,2H),4.09(d,J=20.6 Hz,2H),3.93(d,J=6.5 Hz,9H),2.40(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.18(s),165.98(s),153.31(s),147.24(s),141.59(s),140.51(s),139.87(s),135.03(s),128.92(s),127.73(s),126.04(s),123.52(s),123.10(s),123.03(s),119.53(s),115.29(s),112.59(s),112.36(s),109.27(s),108.77(s),97.22(s),64.90(s),61.05(s),56.25(s),41.00(s),29.28(s),28.76(s). MS(ESI):521.1(C28H25ClN2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(9)：黃色粉末,產(chǎn)率: 72%，Mp:175-178℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=6.4 Hz,1H),7.75(d,J=8.4 Hz,1H),7.40(dd,J=15.9,8.3 Hz,3H),7.15(s,2H),6.78(d,J=6.8 Hz,2H),6.68(s,1H),4.62(t,J=6.8 Hz,2H),4.14(s,2H),3.95(t,J=10.9 Hz,9H),2.45(d,J=5.6 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.17(s),165.94(s),153.31(s),147.23(s),141.00(s),139.88(s),135.45(s),127.72(s),126.03(s),125.69(s),123.99(s),123.64(s),121.72(s),115.32(s),112.64(s),112.31(s),110.30(s),108.78(s),97.22(s),65.17(s),61.04(s),56.21(s),41.80(s),29.57(s). MS(ESI):554.1(C29H25F3N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(10)：黃色粉末,產(chǎn)率: 61%，Mp:160-163℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71(d,J=8.2 Hz,2H),7.31(s,1H),7.25(d,J=3.2 Hz,2H),7.15(s,2H),6.77-6.65(m,3H),4.23(t,J=6.9 Hz,2H),4.10(dd,J=14.1,8.6 Hz,2H),3.94(t,J=10.4 Hz,9H),2.64(s,3H),2.15-1.99(m,2H),1.89(d,J=6.3 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.77(s),168.20(s),166.39(s),153.32(s),151.32(s),147.29(s),142.71(s),135.06(s),127.78(s),125.95(s),122.10(s),121.93(s),119.23(s),115.07(s),112.27(s),112.20(s),109.04(s),108.76(s),97.21(s),68.17(s),61.04(s),56.25(s),43.49(s),26.60(s),26.45(s),14.05(s). MS(ESI):514.1(C30H30N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(11)：黃色粉末,產(chǎn)率: 60%，Mp:163-166℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.61(q,J=8.0 Hz,3H),7.33-7.12(m,4H),6.75-6.50(m,3H),4.24(t,J=6.7 Hz,2H),4.01(t,J=5.5 Hz,2H),3.85(t,J=9.3 Hz,9H),2.13-1.92(m,2H),1.89-1.74(m,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.78(s),168.19(s),166.40(s),153.31(s),147.29(s),141.79(s),140.45(s),139.85(s),134.94(s),127.78(s),125.93(s),123.27(s),122.80(s),119.63(s),115.04(s),112.26(s),112.23(s),109.35(s),108.75(s),97.21(s),69.53(s),68.06(s),61.03(s),56.23(s),53.80(s),53.47(s),44.11(s),31.76(s),29.28(s),26.24(s),26.18(s). MS(ESI):534.1(C29H27ClN2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(12)：黃色粉末,產(chǎn)率: 63%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.92(d,J=7.8 Hz,1H),7.72(t,J=8.4 Hz,1H),7.48(q,J=8.0 Hz,2H),7.42(dd,J=14.8,7.5 Hz,1H),7.17(s,2H),6.81-6.68(m,2H),5.32(s,1H),4.47(t,J=7.3 Hz,2H),4.15(t,J=5.1 Hz,2H),3.96(t,J=10.3 Hz,9H),2.25-2.09(m,2H),1.98(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.79(s),168.20(s),166.33(s),153.32(s),147.28(s),141.21(s),139.87(s),135.31(s),127.78(s),125.96(s),125.46(s),123.78(s),121.87(s),115.13(s),112.29(s),112.22(s),110.42(s),108.76(s),97.22(s),68.03(s),61.03(s),56.23(s),53.45(s),44.77(s),26.86(s),26.26(s). MS(ESI):568.2(C30H27F3N2O6,[M+H+])。

2.2體外抗腫瘤活性化合物4-12的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1?；衔?-12對(duì)MGC-803細(xì)胞株和MCF-7細(xì)胞株更為敏感，IC50值基本小于100 μmol/L?；衔?和11對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶。其中，化合物8的體外抗腫瘤活性最好，對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2的IC50值分別為20.47±2.07 μmol/L、43.42±3.56 μmol/L和35.45±2.03 μmol/L，均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶。

3　討　　論

近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，常用治療以化療為主。但大多數(shù)化療藥物毒性大、不良反應(yīng)多等原因限制了其在臨床方面的應(yīng)用。黃酮類(lèi)化合物因其潛在的腫瘤治療效果和可靠的治療安全性已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[12-13]。而苯并咪唑類(lèi)化合物具有廣泛的生物活性，近些年其抗腫瘤活性方面的研究和開(kāi)發(fā)活躍，進(jìn)展迅速[14-15]。根據(jù)藥效基團(tuán)拼合原理，在本研究中共合成了9個(gè)黃酮苯并咪唑衍生物，通過(guò)體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，黃酮苯并咪唑衍生物具有良好的抗腫瘤作用。由于碳鏈數(shù)的差異并不大，在本研究中鏈長(zhǎng)的增加對(duì)體外抗腫瘤活性的影響并不顯著。其中化合物8體外抗腫瘤活性較好，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶，值得進(jìn)一步探究其抗腫瘤活性與活性機(jī)制，為尋找新型的靶向抗腫瘤藥物提供新的思路。

表1　化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抗活性的測(cè)定